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糖胺聚糖對蛋殼品質(zhì)的調(diào)控

張亞男 王 晶 武書庚?張海軍 岳洪源 齊廣海?

（農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點開放實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，生物飼料開發(fā)國家工程研究中心，北京100081）

E?mail：zyn3299＠126.com

摘 要：糖胺聚糖（GAGs）是雞蛋殼有機(jī)組分中的重要組成部分，參與形成蛋殼的超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控蛋殼品質(zhì)，其分泌貫穿蛋殼形成的全過程。本文從GAGs的種類和生物活性、在蛋殼中的分布和對蛋殼超微結(jié)構(gòu)的作用，及蛋殼中GAGs的調(diào)控等方面，簡述了GAGs影響蛋殼品質(zhì)的研究進(jìn)展，以期為蛋殼品質(zhì)的研究提供新思路。

關(guān)鍵詞：糖胺聚糖；超微結(jié)構(gòu)；蛋殼品質(zhì)

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）是蛋殼基質(zhì)的重要組成部分，貫穿蛋殼形成的全過程［1］，是蛋白聚糖的功能性區(qū)域。作為有機(jī)組分，GAGs和蛋白聚糖可影響鈣化組織結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度和形狀［2］。蛋殼中GAGs和基質(zhì)蛋白等有機(jī)成分與蛋殼強(qiáng)度等品質(zhì)密切相關(guān)［3－4］，蛋殼中蛋白質(zhì)、糖醛酸和酸性GAGs與蛋殼強(qiáng)度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系［5］。并且，蛋殼中蛋白與糖蛋白的不同是造成品種間蛋殼品質(zhì)差異的最終原因［6］。產(chǎn)蛋后期蛋殼膠護(hù)層中的多糖和脂類含量降低，蛋殼厚度和糖基化程度也隨日齡的增加而降低，降低了膠護(hù)層的機(jī)械特性和對細(xì)菌抵抗力［7］，多糖的減少意味著膠護(hù)層蛋白糖基化程度降低［8］，因此，提高糖基化程度可改善蛋殼品質(zhì)。不同種類GAGs的結(jié)構(gòu)有別，各有其作用。蛋殼基質(zhì)薄膜中硫酸角質(zhì)素（KS）蛋白多糖的含量與蛋殼強(qiáng)度顯著相關(guān)、與殼重增加有關(guān)；蛋殼鈣化層中的硫酸皮膚素（DS）蛋白多糖可影響蛋殼的形態(tài)，但不受殼重變化的影響［9］?？梢姡珿AGs及蛋白聚糖對維持蛋殼的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。本文從GAGs種類和生物活性、在蛋殼的分布和對蛋殼超微結(jié)構(gòu)的作用，以及蛋殼中GAGs調(diào)控等方面，簡述了GAGs影響蛋殼品質(zhì)的研究進(jìn)展，以期為蛋殼品質(zhì)的研究提供新思路。

1　GAGs的種類和生物活性

GAGs，又稱黏多糖、氨基多糖、酸性多糖，是動物和植物，特別是高等動物結(jié)締組織中的一類結(jié)構(gòu)多糖，首次發(fā)現(xiàn)于哺乳動物肥大組織。GAGs是一種陰離子線性多糖，由重復(fù)雙糖單位組成，因雙糖單位中至少有1個單糖殘基帶有負(fù)電荷的羧基和硫酸基，故呈酸性。根據(jù)單糖殘基、殘基連鍵的類型以及硫酸基數(shù)目和位置的不同，GAGs家族包含6類成員：透明質(zhì)酸（HA）、硫酸軟骨素（CS）、DS、KS、肝素（Hp）和硫酸乙酰肝素（HS）。GAGs中雙糖的基本組成單位為氨基己糖和糖醛酸，其中氨基己糖為N－乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）或N－乙酰半乳糖胺（GalNAc），糖醛酸為葡糖醛酸或艾杜糖醛酸。KS中不含糖醛酸，為半乳糖代替。GAGs為不分支的長鏈聚合物，各種GAGs主糖鏈差異較小，但之后的硫酸化、脫乙?；筒钕虍悩?gòu)化使各GAGs長鏈之間出現(xiàn)明顯差別，因而生物學(xué)活性不同。除HA以游離形式存在外，其他GAGs均通過絲氨酸殘基與核心蛋白共價連接，組裝成相應(yīng)的蛋白聚糖而發(fā)揮作用［10］。

因結(jié)構(gòu)不同，各種GAGs的生物活性和行使功能有別。HA的結(jié)構(gòu)最簡單，多糖鏈由［→4）Gl?cNAc β1→3GlcA β（1→］重復(fù)二糖組成，不被硫酸化，不與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，以游離形式或非共價復(fù)合體形式存在。HA結(jié)構(gòu)雖簡單但分子量大，因單糖殘基間的β鏈和大量的鏈內(nèi)氫鍵，以及外伸的負(fù)電荷羧基之間的相互斥力，HA在溶液中呈現(xiàn)高度伸展的無規(guī)卷曲，且因其分子表面含有較多親水基團(tuán)，HA可結(jié)合大量的水，黏滯性較大，起潤滑和保護(hù)作用。由于硫酸化位點的不同，最常見的CS主要有4?CS和6?CS，且多數(shù)CS是二者的共聚物。與CS最大的區(qū)別在于，DS糖醛酸單位主要是L－艾杜糖醛酸，并有不定數(shù)量的D－葡糖醛酸。L－艾杜糖醛酸是在差向異構(gòu)酶的作用下，由D－葡糖醛酸C5上發(fā)生異構(gòu)化形成。且L－艾杜糖醛酸一旦形成，在其C2位上即可發(fā)生硫酸化，因此，DS的多糖鏈更加靈活，可與多個特定的蛋白和多糖結(jié)合。KS是唯一不含糖醛酸單體的雜多糖，因雙糖單位中含有半乳糖，故酸性較弱，結(jié)合陽離子的程度較其他GAGs差。根據(jù)與蛋白質(zhì)連接方式（N－鏈接聚糖或O－鏈接聚糖）的不同，KS主要有2種（Ⅰ和Ⅱ），存在于角膜或骨骼中。與其他GAGs顯著不同的是Hp和HS中N－乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以α－1，4鍵相連，但二者N－硫酸化的程度不同，是區(qū)別二者的重要標(biāo)志。HS中，轉(zhuǎn)變?yōu)镹－硫酸的N－乙酰基一般不足50%，Hp中則常達(dá)70%～90%。因差向異構(gòu)作用是可逆的平衡反應(yīng)，而2－硫酸化作用可防止艾杜糖醛酸的逆向反應(yīng)，因此，Hp高度聚陰離子化，每個雙糖中含有4個潛在的陰離子：1個羧基、1個N－硫酸和2個O－硫酸，是一種天然的抗凝劑?？梢?，不同結(jié)構(gòu)的GAGs其生物學(xué)功能不同，結(jié)構(gòu)間的差別主要在于雙糖單位的組成、葡糖醛酸／艾杜糖醛酸及硫酸化程度不同［11］。

2　GAGs在蛋殼的分布及對蛋殼超微結(jié)構(gòu)的作用

研究表明，蛋殼中具有功能的GAGs主要有4種（HA、KS、CS和DS）［12－15］。蛋殼中GAGs由48%的HA和52%的半乳糖胺聚糖（主要是CS和 DS的共聚物）組成［13］。蛋殼膜和蛋殼基質(zhì)中GAGs亞類組成不同，殼膜中主要是HA，其次是HS；蛋殼基質(zhì)中以CS居多，并含有豐富的HA、KS 和HS［15］。蛋殼的形成是一個時序性過程，在輸卵管的不同部位，無機(jī)物和基質(zhì)成分相互作用，由內(nèi)至外依次形成未鈣化的內(nèi)、外蛋殼膜（70 μm）、鈣化的不規(guī)則乳突層（100 μm）、柵欄層（300 μm）、垂直晶體層（3～8 μm）和膠護(hù)層（0.5～12.8 μm）［16－17］。GAGs存在于各結(jié)構(gòu)層中，參與形成超微結(jié)構(gòu)。GAGs是基質(zhì)薄膜纖維核中X膠原蛋白重要的糖組分，參與維持殼膜的完整性和彈性［1］；KS不僅存在于基質(zhì)薄膜中，還與核心蛋白結(jié)合形成高度硫酸化的角質(zhì)素蛋白多糖，與外殼膜纖維共同作用構(gòu)成乳突核，促進(jìn)第一枚晶體的形成；HA和DS蛋白多糖大量存在于蛋殼的柵欄層，構(gòu)成蛋殼最厚層［18－19］；糖蛋白是有機(jī)膠護(hù)層（內(nèi)部鈣化層和外部非鈣化層）的重要組成部分，含量大于90%，蛋白質(zhì)主要存在于外層，內(nèi)層含有豐富的硫酸化蛋白多糖和磷酸鹽［7］。糖醛酸存在于蛋殼基質(zhì)薄膜和礦化層中，其中礦化層中含量較高，比內(nèi)外基質(zhì)薄膜高約5倍，這與糖醛酸在蛋殼礦化過程中發(fā)揮功能相關(guān)［4，20］?？梢?，GAGs廣泛分布在蛋殼各結(jié)構(gòu)層，維持蛋殼結(jié)構(gòu)和功能。

GAGs參與形成蛋殼的超微結(jié)構(gòu)，在維持蛋殼的結(jié)構(gòu)和功能方面有重要作用。研究表明，GAGs及相應(yīng)的蛋白多糖參與蛋殼結(jié)構(gòu)的形成［1］，糖醛酸或其硫酸化部位經(jīng)過適當(dāng)?shù)碾x子化，可單獨(dú)或相互作用，在方解石沉積過程中結(jié)合鈣離子，鈣化程度與GAGs的含量和硫酸化程度密切相關(guān)［11］。在蛋殼形成過程中，輸卵管峽部、紅峽部和蛋殼腺均檢測到KS蛋白多糖和DS蛋白多糖的分泌［1］。KS蛋白多糖被認(rèn)為參與形成乳突層第1枚晶體的成核，DS蛋白多糖作用于鈣化階段，參與調(diào)節(jié)晶體的生長和定向［1，3］。體外研究表明，純化后的蛋殼包含DS蛋白聚糖，可改變方解石的形態(tài)，降低方解石的大小，且對碳酸鈣形態(tài)和大小的影響有劑量依賴性，但超過一定含量，不會再有進(jìn)一步的作用［21］。體外模擬試驗中加入DS與加入子宮液的反應(yīng)相似，都調(diào)控晶體的生長和形態(tài)［11］。蛋雞腹腔注射氯酸鹽，會抑制DS蛋白多糖形成，嚴(yán)重影響蛋殼柵欄層的生長［1］；撤銷抑制劑43 d后，DS蛋白多糖恢復(fù)硫酸化，晶體改變得到恢復(fù)［21］。此外，GAGs是構(gòu)成殼膜纖維和乳突核部的重要組成部分［18］。通過比較有和無乳突核時的殼膜組成，發(fā)現(xiàn)乳突核部富含氨基己糖、唾液酸和己糖，無糖醛酸，提示KS可能參與蛋殼鈣化的起始［22］。乳突體包含的KS蛋白聚糖（對鈣的親和性較低），可作為第1晶體的成核位點，還有益于雛雞對鈣的利用［23］。而膠護(hù)層中含有的KS大分子與乳突核不同，其參與羥基磷灰石的形成，但具體作用仍不清楚［24］。可見，糖醛酸和GAGs及蛋白聚糖在鈣化組織形成和調(diào)節(jié)蛋殼形成過程中發(fā)揮重要作用［25］。

3　蛋殼中GAGs合成和分解的調(diào)控

GAGs在機(jī)體內(nèi)與核心蛋白結(jié)合形成蛋白聚糖（除HA外）而發(fā)揮功能。參與GAGs合成的各種單糖及其衍生物均可由葡萄糖轉(zhuǎn)變，與二磷酸尿苷（UDP）結(jié)合，形成活性單糖。GAGs在細(xì)胞內(nèi)合成，首先核糖體上合成的多肽分泌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在木糖轉(zhuǎn)移酶催化下，1分子木糖基連接到核心蛋白多肽鏈的絲氨酸殘基上，形成O－糖苷鍵，再由半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化，依次轉(zhuǎn)移2分子半乳糖，構(gòu)成“木棸霔半”（O?xyl?galact?galact－）三糖連接區(qū)，然后由高度特異的糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性單糖轉(zhuǎn)移到氨基酸側(cè)鏈，糖鏈合成后需進(jìn)一步修飾，但糖鏈的延伸和加工修飾在高爾基體中進(jìn)行。其中糖基轉(zhuǎn)移酶，尤其半乳糖－β－1，3－葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶（GlcAT?Ⅰ），可將一個葡萄糖醛酸殘基從UDP－葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移到GAGs鏈上［26］；差向異構(gòu)酶可催化葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘盘侨┧?；硫酸轉(zhuǎn)移酶催化硫酸基（由活性硫酸根提供）轉(zhuǎn)移到新合成的多糖鏈的氨基或羥基上，都在GAGs多糖鏈后期組裝過程中發(fā)揮重要作用［27］。GAGs的分解主要在溶酶體，受內(nèi)切糖苷酶、外切糖苷酶及硫酸酯酶等調(diào)控。蛋白聚糖在組織蛋白酶等的作用下，部分肽鏈水解產(chǎn)生帶多糖鏈的小片段，被細(xì)胞吞噬進(jìn)入溶酶體，逐步水解成各種單糖及其衍生物。因此，GAGs的合成和分解主要受各種酶的分隔定位和特異性影響。

蛋殼GAGs由輸卵管和蛋殼腺上皮細(xì)胞和管狀腺細(xì)胞分泌，貫穿蛋殼結(jié)構(gòu)的形成［1］。GAGs可能作為碳酸鈣堆積起始時的晶體核［3］，隨著GAGs合成增加，晶核數(shù)量增長，碳酸鈣圍繞晶核逐漸沉積，而晶核的數(shù)量決定了乳突的密集程度，乳突間距變小。同時，因晶核增多，乳突增長密集，乳突黏合發(fā)生和乳突層輪廓消失較早，降低了乳突層高度。研究表明，乳突層厚度越小，乳突間距越小，蛋殼強(qiáng)度越大［28］。GAGs發(fā)揮以上作用可能與GlcAT?Ⅰ的活性有關(guān)。錳是GlcAT?Ⅰ的活性因子，可調(diào)控蛋殼中GAGs的含量。飼糧錳不足時，蛋殼腺內(nèi)GlcAT?Ⅰ基因和蛋白表達(dá)水平均降低，蛋殼中氨基己糖和己糖醛酸含量降低，乳突層厚度和乳突寬度顯著增加，蛋殼表面裂紋增加，蛋殼品質(zhì)下降［29－30］。Venkatesan等［31］通過導(dǎo)入Gl?cAT?Ⅰ基因，改變GAGs的合成，可增加人軟骨組織中蛋白多糖含量。若阻礙軟骨組織中GlcAT?Ⅰ的表達(dá)，則蛋白多糖合成驟減，終致骨連接功能喪失［32］。蛋殼中糖醛酸和GAGs的含量隨飼糧錳水平（來自硫酸錳，由0提高到100 mg／kg）增加而升高［30］。此外，肖俊峰［28］利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，驗證了錳可提高GlcAT?Ⅰ和β－1，4－半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）的表達(dá)水平，GT可將半乳糖苷從UDP－半乳糖苷轉(zhuǎn)移到N－多糖復(fù)合物末端的GlcNAc上，促進(jìn)N－乙酰半乳糖胺的組成，從而促進(jìn)GAGs的形成，但關(guān)于GT調(diào)控蛋殼品質(zhì)的研究鮮有報道。調(diào)控GlcAT?Ⅰ和GT的活性，促進(jìn)GAGs的合成，是通過GAGs調(diào)控蛋殼品質(zhì)的方向之一。

GAGs的結(jié)構(gòu)隨著機(jī)體的發(fā)育、生長和老化而不斷變化，其含量和結(jié)構(gòu)的差異與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［33］。硫酸化程度對GAGs的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用，尤其HS、CS和DS的活性受硫酸化影響顯著。硫酸轉(zhuǎn)移酶可催化硫酸基結(jié)合到新形成的多糖鏈氨基或羥基上，促進(jìn)蛋白聚糖合成。研究表明，氯酸鹽可抑制糖胺的硫酸化，對CS和DS的抑制作用大于90%，但對其他GAGs的抑制效果較差［34］。氯酸鹽影響蛋殼晶體柵欄層的生長，但對蛋殼晶體初始成核影響較小，主要原因是前者含有大量的CS和DS，而后者由高度硫酸化的KS蛋白聚糖形成。此外，維生素A缺乏時，硫酸轉(zhuǎn)移酶的活性下降，GAGs合成受阻，這可能是飼糧中維生素A缺乏，影響蛋殼品質(zhì)的機(jī)理。由此可見，硫酸轉(zhuǎn)移酶可調(diào)控蛋殼GAGs和蛋白聚糖的硫酸化程度，改變含量和結(jié)構(gòu)，在蛋殼礦化過程發(fā)揮重要作用。調(diào)節(jié)硫酸轉(zhuǎn)移酶的含量和活性，是通過GAGs調(diào)控蛋殼品質(zhì)的又一方向。

GAGs是X膠原纖維重要的糖組分，而蛋殼鈣化結(jié)晶起始于基質(zhì)薄膜交聯(lián)的纖維核上，基質(zhì)薄膜的完整性是蛋殼形成的先決條件，銅缺乏或氨基腈干預(yù)導(dǎo)致的殼膜交聯(lián)異常，均不利于后續(xù)蛋殼的結(jié)構(gòu)形成［35－36］。因此，GAGs可能通過影響殼膜纖維的交聯(lián)程度和完整性，直接影響晶體成核位點的形成，進(jìn)而改變超微結(jié)構(gòu)，調(diào)控蛋殼品質(zhì)。研究表明，飼糧缺銅可降低雞蛋大小的均一性，形狀異常、蛋殼粗糙和褶皺，改變蛋殼乳突層的結(jié)構(gòu)，主要原因是蛋殼基質(zhì)薄膜的改變，銅依賴性的交聯(lián)減少，GAGs位于膠原纖維，但是否也通過GAGs發(fā)揮作用尚不清楚。因此，明確GAGs調(diào)控蛋殼品質(zhì)的機(jī)理，對通過營養(yǎng)調(diào)控蛋殼品質(zhì)具有重要意義。

GAGs作為蛋白聚糖的功能區(qū)域，需與相應(yīng)的核心蛋白結(jié)合發(fā)揮作用，如DS蛋白聚糖的核心蛋白是OC?116［12］，貫穿柵欄層的形成，調(diào)節(jié)柵欄層的厚度。研究并發(fā)現(xiàn)不同GAGs的核心蛋白，并探究其相互作用，是通過GAGs調(diào)控蛋殼品質(zhì)的另一切入點。

4　小 結(jié)

綜上，GAGs廣泛存在于蛋殼中，參與超微結(jié)構(gòu)形成，進(jìn)而調(diào)控蛋殼品質(zhì)。但GAGs調(diào)控蛋殼超微結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制尚不明確，且GAGs的種類和數(shù)量隨蛋殼超微結(jié)構(gòu)層不同而改變，發(fā)揮的位點和時間也有所差別。因此，利用先進(jìn)技術(shù)，觀測蛋殼形成中GAGs的時序性變化，將有助于揭示GAGs在蛋殼超微結(jié)構(gòu)形成過程中的生物學(xué)作用，同時為營養(yǎng)調(diào)控蛋殼品質(zhì)提供新思路。

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Regulation of Glycosaminoglycans on Eggshell Quality

ZHANG Ya’nan WANG Jing WU Shugeng?ZHANG Haijun YUE Hongyuan QI Guanghai?

（Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture，F(xiàn)eed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Engineering Research Center of Biological Feed，Beijing 100081，China）

（責(zé)任編輯 陳 燕）

E?mail：wushugeng＠caas.cn；QI Guanghai，professor，

E?mail：qiguanghai163＠ 163.com

Abstract：Glycosaminoglycans（GAGs）are one of the important constitute of eggshell organic matrix，which is involved in the formation of eggshell ultrastructure，and consequently affects eggshell quality.GAGs are syn?thesized and secreted in the process of eggshell formation.In the paper the GAGs families and their bioactivi?ties，distributions and effects of GAGs on eggshell ultrastructure，and modulation of GAGs in eggshell were presented，meanwhile，research progress on the effects of GAGs on regulation of eggshell quality was reviewed with the aim of providing a new idea for eggshell quality improvement.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2015，27（11）：3332?3337］

Key words：glycosaminoglycans；ultrastructure；eggshell quality

Corresponding author?s：WU Shugeng，associate professor，

doi：10.3969／j.issn.1006?267x.2015.11.003

文章編號：1006?267X（2015）11?3332?06

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S816.7；S831

作者簡介：張亞男（1988—），女，山東德州人，博士研究生，從事蛋品質(zhì)營養(yǎng)調(diào)控研究。

基金項目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS?41?K13）；家禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊（CARS?PSTP）；國家科技支撐計劃（2011BAD26B03）；國家自然科學(xué)基金（31572426）

收稿日期：2015－05－27

通信作者：?武書庚，副研究員，碩士生導(dǎo)師，
E?mail：wushugeng＠caas.cn；齊廣海，研究員，博士生導(dǎo)師，
E?mail：qiguanghai163＠163.com