高 貝，程丹丹，辛?xí)詡?，高德?/p>

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

HPLC法測定有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指紋圖譜分析

高 貝，程丹丹，辛?xí)詡?，高德?

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

目的:通過HPLC法對有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素含量的測定，以控制石韋藥材質(zhì)量,建立石韋藥材中綠原酸及木犀草素的含量測定方法，同時對有柄石韋及華北石韋中綠原酸及木犀草素的含量進行比較以及對不同浸提物的指紋圖譜進行分析。方法:用hypersil ODS-2柱,流動相為乙腈-0.5%磷酸水(9 ∶91), 檢測波長326 nm，流速1 mL·min-1。結(jié)果:各峰可較好的分離，有柄石韋中綠原酸的含量可達到1.51%。結(jié)論:該方法操作簡便，結(jié)果準確，具有較好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，可用于有柄石韋及華北石韋中綠原酸和木犀草素含量測定。

HPLC; 有柄石韋；華北石韋; 綠原酸；木犀草素

石韋為水龍骨科(Polypodiaceae)植物廬山石韋[Pyrrosiasheareri(Bak.)Ching]、石韋[Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell]和有柄石韋[Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching]的干燥葉[1]。生于裸露干旱巖石上，海拔250～2 200 m。綠原酸具有廣泛的生物活性，可以有效清除體內(nèi)的自由基，具有較強的抑制突變，抗癌，抑菌的作用，能利膽、降壓、顯著增加胃腸蠕動和促進胃液分泌[2]；木犀草素具有抗腫瘤、抗應(yīng)變性、抗病毒、抗炎、抗氧化、和保護細胞的作用，對白血病細胞、腫瘤細胞和神經(jīng)元細胞生物學(xué)功能有影響[3]。華北石韋未被藥典收錄到石韋藥材中，HPLC為藥典規(guī)定的石韋中綠原酸含量測定方法。本研究主要采用高效液相色譜法對兩種石韋中綠原酸和木犀草素的含量測定，以期為藥用石韋擴大資源，合理開發(fā)利用，控制藥材質(zhì)量及進一步化學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要試藥

對照品綠原酸(上海金穗生物科技有限公司；20130916)，木犀草素(上海金穗生物科技有限公司；20131021)乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。 有柄石韋，華北石韋(采自膠東，2013.09.06)經(jīng)高德民副教授鑒定，保存于山東中醫(yī)藥大學(xué)標本館。

1.2 儀器

浙大智達N2000高效液相色譜儀(浙江大學(xué)智達信息工程有限公司)；萬分之一分析天平(上海菁海儀器有限公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 Shim-pack VP-ODS (4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為乙腈-0.5% 磷酸水(9 ∶91);檢測波長0～45 min 為 326 nm，流速為 1.0 mL·min；柱溫為 25 ℃[1，8]。

2.2 溶液的制備[1]

2.2.1 對照品溶液的制備[4,5]

精密稱取綠原酸、木犀草素對照品各5 mg，加 50%甲醇溶解,分別制成 0.5,0.25 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取有柄石韋及華北石韋粉末(過2號篩)1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇40 mL,密塞,稱重,超聲處理45 min,取出,放冷,再稱重,用50%甲醇補足失重,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得，備用。精密稱取有柄石韋粉末1 g,按以上方法，制備水，甲醇，乙醇(50%)，丙酮浸提物[6-7]。

2.3 線性關(guān)系考察試驗

分別精密量取上述綠原酸，木犀草素對照品溶液2,5,10,15,20μL進樣[8]，以色譜峰面積(Y)對質(zhì)量(X)進行回歸，木犀草素的線性回歸方程為Y=3 634 201X+26 587，r=0.999 9，線性范圍為0.029 7～0.42 μg。綠原酸的線性回歸方程為Y=25 089X+840 462，r=0.999 8，線性范圍為0.018～0.89 μg。

2.4 精密度試驗

取上述對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣5次，測得木犀草素的峰面積RSD為0.75%，綠原酸的峰面積RSD為0.45%，表明儀器進樣精密度良好[9-10]。

2.5 穩(wěn)定性試驗取

取上述對照品溶液20 μL分別在0、2、4、6、8、12 h進樣，測定木犀草素的峰面積RSD為1.98%，綠原酸的峰面積RSD為0.87%表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定[11]。

2.6 重現(xiàn)性試驗

取同批有柄石韋及華北藥材，按供試品制備方法配制6份，分別進樣20 μL，測定木犀草素，綠原酸的峰而積RSD分別為1.98%，1,69%，表明該方法的重現(xiàn)性較好[12]。

2.7 樣品測定

按上述待測溶液的制備方法制備溶液,按綠原酸和木犀草素測定色譜條件,對待測樣品進行測定[1],外標法計算含量，得到回歸方程為：綠原酸Y=25 089X+840 462,r=0.999 0;木犀草素Y=11 651X+10r=0.999 7。利用面積歸一化法對1～8號物質(zhì)進行相對含量測定。

2.8 結(jié)果

圖1 有柄石韋(A)、華北石韋(B)、對照品(C)、陰性對照(D)的HPLC指紋圖譜

圖2 有柄石韋水(A)，甲醇(B)，乙醇(50%)(C),丙酮(D)浸出物HPLC指紋圖譜

表1 有柄石韋、華北石韋中綠原酸及木犀草素的含量

圖3 有柄石韋不同浸出物中各峰處物質(zhì)的相對含量

2.8.1 結(jié)果分析

有HPLC指紋圖譜可知各峰分離效果較好,與相鄰峰能達到基線分離,無重疊峰,R>2.0,保留時間合適,穩(wěn)定,重現(xiàn)性好。

2.8.2 驗證試驗

按照實驗條件進行多次實驗，以驗證該工藝的精密性，可重復(fù)性和穩(wěn)定性，結(jié)果無顯著差異，結(jié)果精密度良好，方法穩(wěn)定，準確，可靠。

3 討 論

結(jié)果表明有柄石韋和華北石韋所含化學(xué)成分的種類基本相似，但各成分的含量有很大差異。HPLC指紋圖譜分離度較好(圖1)，穩(wěn)定可靠,建立了石韋中綠原酸與木犀草素的HPLC測定方法。可作為石韋近似種的鑒別及進一步的成分研究提供基礎(chǔ)材料。有柄石韋和華北石韋中綠原酸的含量均達到藥典要求(不得少于0.20%)，有柄石韋中綠原酸的含量明顯高于華北石韋，但木犀草素的含量明顯低于華北石韋(表1)。單從綠原酸含量可以考慮將其歸入藥用石韋，但仍需做進一步的藥效，藥理及臨床實驗。這為中藥石韋的深入開發(fā)研究提供參考，也為藥材鑒別提供了科學(xué)依據(jù)[13-14]。

有柄石韋不同浸提物中的成分及含量存在很大差異，化合物1在甲醇和乙醇浸提物中含量較高，5，6在丙酮，8在水提物中相對含量較高，2, 5在水提物中相對含量較少，4在乙醇提取物中的含量最低，在其它提取物中相差不大，7在各提取物中所咱的相對含量沒有明顯差別(圖2，3)。這為進一步有柄石韋的提取，分離及有效成分分析提供基礎(chǔ)材料[15]，也為石韋藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 譚成玉，胡建恩，王煥弟，等.植物雅龍果的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2005，40(24)：185-186.

[3] Fotsis T，Pepper M S，Akatas E，et al.Flavonoids，Dietary-derived Inhibitors of Cell Proliferation and in Vitro Angiogenesis[J].Cancer Res，1997，57(14)：2916-2921.

[4] 謝文湖, 江豐.HPLC法測定不同產(chǎn)地中藥石韋的綠原酸含量[J].江西化工，2009，2:62-64.

[5] 張亞寧, 吳博, 楊吉剛, 等.HPLC法測定石韋中木犀草素的含量[J].藥學(xué)實踐雜志2006；24(6):359-361.

[6] Liang Zhitao, Chen Hubiao, Yu Zhiling,et al.Comparison of raw and processed Radix Polygoni Multiflori (Heshouwu) by high performance liquid chromatography and mass spectrometry[J].Chin Med， 2010; 5:29.

[7] Cai Hao,Xu Zhiwei, Cai Baochang.Study on chemical fingerprinting of crude and processed Atractylodes macrocephala from different locations in Zhejiang province by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with hierarchical cluster analysis[J].Pharmacognosy Magazine, 2012,8(32):300-307.

[8] 李坤平, 高崇凱, 李衛(wèi)民.布渣葉藥材中黃酮的高效液相色譜指紋圖譜分析[J].理化檢驗-化學(xué)分冊, 2011,47(2):194-196.

[9] 張一芳，周淑琴，杜文煒.敗醬草藥材高效液相色譜指紋圖譜鑒別研究[J].中國藥業(yè)，2011,20(12):25-26.

[10] 林瑞民, 王大為, 熊志立, 等.補骨脂中兩個黃酮類成分的高效液相色譜測定[J].中國中藥雜志, 2002,27(9):669-671.

[11] 李玉華, 彭敬東, 鄭 敏, 等.HPLC法同時測定石韋藥材中綠原酸、芒果苷和木犀草素的質(zhì)量濃度[J].西南師范大學(xué)學(xué)報, 2011,36(2):104-107.

[12] 馬 晨,周 圓,劉愛茹.高效液相色譜法測定中藥石韋2種成分的含量[J].藥學(xué)學(xué)報, 2003,38(4):286-289.

[13] Mant C T, Chen Y, Yan Z, et al.HPLC analysis and purification of peptides[J].Methods Mol Biol,2007,386:3-55.

[14] 黃艷，溫幼敏，馬軍花，等.光石韋藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志， 2013,19(11)：152-155.

[15] 李潔，童玉鼓.石韋有效成分的高效液相色譜測定[J].藥學(xué)學(xué)報， 1992,27(2):153-156.

Determination of Chlorogenic Acid and Mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching by HPLC andAnalysis of Fingerprints from Different Extraction

Gao Bei, Cheng Dandan, Xin Xiaowei, Gao Demin

(School of Pharmacy, Shandong University of TCM, Jinan 250355, China)

Objective:HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching，for quality control, establish the content determination method and the comparison in content of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching, at the same time, analyze fingerprints from different extraction.Method:With ODS-C18column, mobile phase acetonitrile-phosphate (0.5% ) (9:91), wavelength 326 nm, flow rate 1 mL·min-1.Results:The peaks can be good separated, the content of chlorogenic acid can reach 1.51% inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching.Conclusion:The method is simple and good reproducibility, and can be used for determination of chlorogenic acid and mignonette inPyrrosiapetiolosa(Christ) Ching andPyrrosiadavidii(Baker) Ching.

HPLC;Pyrrosiapetiolosa(Christ) Ching；Pyrrosiadavidii(Baker) Ching; chlorogenic acid； mignonette

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.01.006

2014-07-12

山東中醫(yī)藥大學(xué)2012年SRT資助項目。

R284.1

A

1006-9690(2015)01-0019-03