西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科(西安 710061)

吳 迪 劉亞林 王夢(mèng)昌▲

PIK3R1 對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制初探*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科(西安 710061)

吳 迪 劉亞林 王夢(mèng)昌▲

目的：觀察應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)敲低PIK3R1表達(dá)后在體外對(duì)人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞侵襲的抑制作用。方法：將重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-1.1-PIK3R1轉(zhuǎn)染至RPMI8226細(xì)胞。Realtime PCR和Western blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后目的基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的濃度變化。Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果：pGenesil-1.1-PIK3R1可以有效抑制PIK3R1 mRNA及蛋白的表達(dá),MMP-2、MMP-9表達(dá)下調(diào),基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)-2表達(dá)上調(diào)，ELISA證實(shí)細(xì)胞外MM9-2、MMP-9濃度在治療組明顯減低。Tramwell穿過細(xì)胞數(shù)：對(duì)照組(115.5±3.9)和無義序列組(112.8±6.0), pGenesil-1.1-PIK3R1轉(zhuǎn)染組(73.7±4.0)。結(jié)論：靶向PIK3RI的RNAi技術(shù)可以序列特異性地抑制PI3KR1表達(dá),在體外明顯抑制RPMI8226細(xì)胞的侵襲能力。

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是發(fā)生于B細(xì)胞終末階段漿細(xì)胞的惡性血液系統(tǒng)腫瘤,至今仍不可治愈。這主要與MM患者髓外浸潤的發(fā)生密切相關(guān)。MM患者的髓外浸潤事件常常與骨髓瘤細(xì)胞增強(qiáng)的侵襲活性、復(fù)雜的細(xì)胞遺傳學(xué)異常伴隨發(fā)生?；虻漠惓１徽J(rèn)為是多發(fā)性骨髓瘤疾病致病的重要因素。然而，目前使骨髓瘤細(xì)胞具有增強(qiáng)的侵襲活性的分子機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切[1-2],PIK3R1(phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1, p85 alpha)基因負(fù)責(zé)編碼磷脂酰肌醇3-激酶(Phisphatidylinositol 3-kinase, PI3K)中85kD大小的調(diào)節(jié)亞基—p85α，p85α是PI3K家族中表達(dá)量最多的調(diào)節(jié)亞基,各種相關(guān)信號(hào)分子都需要與p85亞基結(jié)合后,才能激活PI3K,進(jìn)而通過多種信號(hào)傳導(dǎo)通路影響細(xì)胞生長、分化、黏附及細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[3-4]。目前，對(duì)于PIK3R1是否能夠影響MM細(xì)胞的侵襲活性，PIK3R1以及PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MM患者中的作用知之甚少。因此,本文應(yīng)用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的PIK3R1 siRNA轉(zhuǎn)染人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226和純化的原代多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,使PIK3R1基因下調(diào),從而觀察PIK3R1對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程、侵襲活性的影響,并檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路在MM細(xì)胞中的表達(dá),以了解其可能的作用機(jī)制,為基因治療多發(fā)性骨髓瘤提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 人類多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226 (本實(shí)驗(yàn)室保存)。pGenesil-1.1 購自Genesil生物技術(shù)公司。RPMI1640購自美國生命技術(shù)公司(Gibco/BRL)，多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。Western blot所用試劑購自美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。引物序列：人PIK3R1引物上游5'-AGCATTGGGACCTCACATTACACA-3', 下游引物5'- ACTGGAAACACAGTCCATGCACATA-3'，內(nèi)參照上游引物為5'- TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'，下游引物5'-CTCCGACCTTCACCTTCC-3'。Transwell購自Costar公司。

2 方 法 ①質(zhì)粒載體pGenesil-1.1-PIK3R1構(gòu)建：(干擾序列：GTAAAGCATTGTGTCATA,位于編碼區(qū)2040-2058)。根據(jù)Genebank報(bào)道的PIK3R1的mRNA序列(NM_181523.1),參考siRNA的設(shè)計(jì)原則[5],利用Ambion公司siRNA在線設(shè)計(jì)軟件從PIK3R1核心蛋白基因起始密碼子下游尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶序列。經(jīng)BLAST Search檢索確認(rèn)與PIK3R1以外的人類已知基因序列無同源性。此外設(shè)計(jì)合成了針對(duì)與人PIK3R1序列無關(guān)的序列作為陰性對(duì)照,目標(biāo)基因序列為5'-GACTTCATAAGGCGCATGC -3',以及針對(duì)管家基因GAPDH的RNAi序列作為陽性對(duì)照, 目標(biāo)基因序列為5'-GTGGATATTGTTGCCATCA -3'。針對(duì)靶序列分別合成1對(duì)寡核苷酸鏈順序依次為CACC、19 nt正義序列、9 nt loop插入序列(5'-TTCAAGACG-3')、19 nt反義序列、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(5個(gè)T)、SacI酶切位點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)粒酶切、連接及鑒定，構(gòu)建干擾質(zhì)粒載體pGenesil-1.1-PIK3R1。②細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)RPMI8226細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2孵箱濕潤培養(yǎng)。③實(shí)驗(yàn)分組與轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組(contro1)、無義序列組(HK)、重組質(zhì)粒pGenesil-1.1-PIK3R1 (P+P)。轉(zhuǎn)染：棄培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)液7～8ml，加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。重組質(zhì)粒中有熒光蛋白真核表達(dá)框，因此可以通過熒光計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。計(jì)算轉(zhuǎn)染率>95%可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。④Real-time PCR：轉(zhuǎn)染后48h，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR擴(kuò)增體系50μl：SYBR Green 25μl，ROX 1μl，ddH2O 20μl，cDNA50ng，上游引物20pmol，下游引物20pmol。反應(yīng)條件：StageI：95 ℃ 10 s(循環(huán)數(shù)1)，Stage2：95℃ 5s， 60℃ 31s(循環(huán)數(shù)40)。另取不同的模板濃度(0.2、2、20、200ng)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，制定各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定各樣本 PCR 反應(yīng)液的熔解曲線，每樣本做 3 個(gè)復(fù)管。用Bio-Rad iQ5自帶軟件求出各樣本的CT值，2 -△△CT方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。⑤Western blot：轉(zhuǎn)染48～72h收集細(xì)胞，PBS沖洗2次, 加RIPA細(xì)胞裂解液裂解，超聲破碎，細(xì)胞蛋白樣品于100℃水浴5 min。將各組細(xì)胞樣品的蛋白濃度調(diào)整一致后，各取20μl上樣進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完畢后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，PVDF膜以含2%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉2 h，加PIK3R1多克隆抗體(工作濃度1∶200)， 4℃孵育過夜，山羊抗小鼠二抗(1∶2000)室溫孵育2h, ECL試劑于暗室自顯影，X線膠片曝光，于自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下成像并分析結(jié)果。⑥酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：常規(guī)轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)48h后各提取培養(yǎng)液1ml，參照ELISA試劑盒說明，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-2、MMP-9濃度。分別將抗人MMP-2/MMP-9單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中的MMP-2/MMP-9與單抗結(jié)合，加人生物素化的抗人MMP-2 /MMP-9，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測(cè)OD值,MMP-2/MMP-9濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中MMP-2/MMP-9濃度。⑦Transwell實(shí)驗(yàn)：在Transwell上室的聚碳酸酯膜(直徑6.5mm)上先加入1:2 (matrigel:RPMI1640)的Matrigel 60～80μl，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠。Transwell下室中加入10%FBS的完全培養(yǎng)基600μl；待檢細(xì)胞無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液(設(shè)復(fù)孔3個(gè))；在上室孔中加入細(xì)胞l×105個(gè)/孔，細(xì)胞懸液體積150μl，常規(guī)培養(yǎng)24h拭去上面的Matrigel膠，蘇木素染色，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)背面穿過的腫瘤細(xì)胞數(shù)，各選8個(gè)視野，計(jì)算平均值。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果 質(zhì)粒pGenesil-1.1 的多克隆位點(diǎn)(MCS)如下：-MluI-hU6 promoter-Insert DNA-SacI-。送轉(zhuǎn)化菌液去測(cè)序，經(jīng)測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)錄模板序列相同(見圖1)。

2 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后目的基因mRNA的表達(dá)(ΔCt值) PIK3R1(對(duì)照組11.993±0.163、HK組12.077±0.148、P+P組12.961±0.169)，經(jīng)分析P+P組與對(duì)照組和HK組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 質(zhì)粒pGenesil-1.1模式圖及重組質(zhì)粒pGenesil-1.1-PIK3R1測(cè)序結(jié)果

3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后目的基因及其相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況 見圖2。HK組的目的蛋白條帶灰度值為對(duì)照組的.PIK3R1(112.94±3.74)%；P+P組的目的蛋白條帶灰度值為對(duì)照組的PIK3R1(29.06±16.17)%，表明轉(zhuǎn)染后p85α的蛋白表達(dá)明顯減低。P+P組的其他相關(guān)因子分別為對(duì)照組的MMP-2(28.38±7.37)%、MMP-9(42.26±9.46)%、TIMP-2(223.23±18.04)%。

圖2 p85α蛋白印跡結(jié)果

4 ELISA 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組培養(yǎng)液MMP-2濃度為對(duì)照組：(129.72±6.33)μg/L，HK組：(127.68±3.68) μg/L，轉(zhuǎn)染組：(69.32±3.38)0μg/L；MMP-9濃度為對(duì)照組：(132.77±24.50) μg/L，HK轉(zhuǎn)染組：(128.32±17.21) μg/L，A+P轉(zhuǎn)染組：(39.94±6.07) μg/L。與對(duì)照組和HK組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

5 Transwell實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示對(duì)照組、HK組穿過細(xì)胞數(shù)分別為(115.5±3.9)和(112.8±6.0)，而P+P組為73.7±4.0)。經(jīng)分析與對(duì)照組和HK組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

MM重要特征之一為骨髓中多部位受惡性漿細(xì)胞累及，并浸潤其他器官,臨床上，約有5%的MM患者進(jìn)展為漿細(xì)胞白血病。由于現(xiàn)有的治療手段使MM患者總的生存時(shí)間延長，因此臨床上觀察到MM患者髓外浸潤的發(fā)生率升高[6]。雖然先進(jìn)的治療手段不斷出現(xiàn)，但MM患者的預(yù)后仍然很差。眾所周知，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力不僅是惡性腫瘤的重要標(biāo)志，還與較差的臨床預(yù)后緊密相關(guān)。骨髓瘤細(xì)胞遷移是非常有害的病理過程，使細(xì)胞具有侵襲和播散能力。然而目前調(diào)節(jié)骨髓瘤細(xì)胞遷移至骨髓并侵襲其他部位的機(jī)制卻知之甚少。如果這些機(jī)制能夠被闡明，對(duì)于尋找新的治療方法將有很大的幫助[7-8]。

PI3K是生長因子超家族信號(hào)傳導(dǎo)過程中的重要分子，可被多種細(xì)胞因子和理化因素激活，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如凋亡、增殖、代謝、生長轉(zhuǎn)化、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和趨化等，并在炎癥、腫瘤、代謝和心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[3-4]。PI3K由110kD大小的催化亞基和85kD、55 kD或50 kD大小的調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成，能夠磷酸化磷脂酰肌醇上的肌醇環(huán)。PIK3R1基因負(fù)責(zé)編碼調(diào)節(jié)亞基p85α，各種信號(hào)分子都需要與p85亞基結(jié)合后，才能激活PI3K，它的表達(dá)上調(diào)會(huì)引起PI3K的活性增強(qiáng)[5-6]。PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的基因突變、缺失，蛋白表達(dá)異常，與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為和預(yù)后有密切關(guān)系。PIK3R1表達(dá)異常與多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)[9]，因此，我們選擇探索下調(diào)PIK3R1的表達(dá)來抑制骨髓瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的效果及可行性。

研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGenesil-1.1-PIK3R1后PIK3Rl的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯抑制，同時(shí)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平亦下降，TIMP-2則表達(dá)上調(diào)。MMP-2、MMP-9是與腫瘤侵襲密切相關(guān)的細(xì)胞因子，它們通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，TIMP則是MMPs的抑制劑，它可通過與MMPs的活化形式結(jié)合抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PIK3R1基因下調(diào)后TIMP-2表達(dá)上調(diào)，MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)均證實(shí)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著減弱。提示P13K/AKT不僅能直接調(diào)控MMP-2、MMP-9的表達(dá)，還可通過調(diào)節(jié)TIMP-2間接影響MMP-2、MMP-9的活性。

本研究結(jié)果表明，P13K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活可直接抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)，同時(shí)還能激活TIMP-2的表達(dá)，從而抑制MMP-2、MMP-9的活性，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的目的。特異阻斷MM中P13K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的聯(lián)合基因治療能顯著減弱MM腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，有望成為MM基因治療的新策略之一。

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(收稿：2014-08-07)

Experimental study on targeting PIK3R1 by RNAi suppressing Multiple Myeloma invasion and metastasis in vitro

Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Medical College of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Wu Di Liu Yalin Wxkl;'wertyuiop[ang Mengchang

Objective：To observe the inhibitory effects on the invasion and metastasis of Multiple Myeloma RPMI8226 cells line by small hairpin RNA targeting PIK3R1 in vitro. Methods：The recombinant plasmid vector expression vector which contained PIK3Rl shRNA was transfected into RPMI8226 cells. Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of P1K3Rl. ELESA was used to measure the change in the MMP-2 /MMP-9 expression．The invasion ability of the tumor cells was examined by Transwell tests．Resuits：pGenesil-1.1-PIK3R1 mediated shRNA targeting PIK3R1 dramatically down-regulated their expression in RPMI8226 cells. MMP-2 and MMP-9 were downregulated, and TIMP-2 was upregulated. The extracellular levels of MMP-2 and MMP-9 were decreased. Transwell showed that the number of cells invading through the matrigel in control, nonsense sequence．And pGenesil-1，1-PIK3R1 transfection groups were 115.5±3.9, 112.8±6.0, and 73.7±4.0 respectively. Conclusion：ShRNA targeting PIK3R1 down-regulated significantly their expression in a sequence-specific manner，and inhibited the invasion of Multiple Myeloma RPMI8226l cells in vitro．

Multiple myelom Neoplasm metastasis Gene therapy @PIK3R1

*陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2011k13-01-03)

▲通訊作者

多發(fā)性骨髓瘤 腫瘤轉(zhuǎn)移 基因治療 @PIK3R1

R733.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.02.002