周志剛 羅薇絮 張學(xué)強(qiáng) 覃 肯 竇傳字 吳煥淦

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203；2 江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌，330004)

針灸經(jīng)絡(luò)

隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔穴區(qū)線粒體及I型膠原蛋白的影響

周志剛1,2羅薇絮2張學(xué)強(qiáng)2覃 肯2竇傳字1吳煥淦1

(1 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海，201203；2 江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌，330004)

目的：觀察隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔胃黏膜損傷指數(shù)、穴區(qū)局部線粒體結(jié)構(gòu)、I型膠原蛋白表達(dá)的影響，從胃黏膜修復(fù)及腧穴局部能量代謝角度探討隔藥灸對急性胃黏膜損傷的起效機(jī)制。方法：新西蘭兔隨機(jī)分為正常組、模型組、隔藥灸組和西藥組。在成功制備急性胃黏膜損傷模型的基礎(chǔ)上，隔藥灸組取“后三里穴”進(jìn)行治療，西藥組以硫糖鋁灌胃治療。各組治療干預(yù)結(jié)束后，留取胃黏膜和穴區(qū)局部組織，采用Guth法對各組的胃黏膜損傷指數(shù)進(jìn)行評分，透射電鏡觀察后三里穴位局部組織線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，免疫組化法檢測穴區(qū)I型膠原蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與正常組比較，模型組、西藥組和隔藥灸組家兔胃黏膜損傷指數(shù)均顯著升高(均P<0.01)；模型組穴區(qū)細(xì)胞線粒體空泡化，I型膠原蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；隔藥灸組僅有少數(shù)線粒體水腫；西藥組線粒體數(shù)目少、出現(xiàn)腫脹，線粒體嵴不明顯。與模型組比較，隔藥灸組和西藥組胃黏膜損傷指數(shù)顯著下降(均P<0.01)，I型膠原蛋白表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)。隔藥灸組胃黏膜損傷指數(shù)低于西藥組(P<0.01)，I型膠原蛋白表達(dá)高于西藥組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：隔藥灸能夠改善急性胃黏膜損傷家兔“后三里”穴穴區(qū)線粒體形態(tài)、提高急性胃黏膜損傷家兔后三里穴局部組織的I型膠原蛋白的表達(dá)，這可能是其修復(fù)胃黏膜損傷的起效途徑之一。

隔藥灸；急性胃黏膜損傷；線粒體；I型膠原蛋白；胃黏膜保護(hù)

灸法是以常見的艾絨為材料，點(diǎn)燃后直接或間接熏灼穴位的傳統(tǒng)療法，具有悠久的歷史?！侗怡o心書》就提到“保命之法，艾灼第一”，《醫(yī)學(xué)入門》中記載“凡病藥之不及，針之不到，必須灸之”?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，艾灸時(shí)產(chǎn)生的溫?zé)岽碳?、紅外輻射以及艾灸生成物均是其起效的重要因素，而人體對溫?zé)岽碳?、紅外輻射等的反應(yīng)是艾灸起效的科學(xué)基礎(chǔ)。艾灸的局部起效機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，施灸局部皮下和肌肉層都不同程度的受到施灸影響，從而產(chǎn)生溫度變化，并推測可能是溫度的變化改變了多種感受器的活動[1]。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隔藥灸可以提高急性胃黏膜損傷家兔穴區(qū)局部Na+/K+-ATP酶的活性，改善胃黏膜AB/PAS陽性層厚度，提示艾灸的修復(fù)效應(yīng)與提高腧穴局部組織Na+/K+-ATP酶活性有關(guān)。ATP能量代謝和疾病的病理狀態(tài)密切相關(guān)，艾灸的近外紅光譜與腧穴自發(fā)的紅外光譜具有相似性，這可能引發(fā)共振，從而促進(jìn)機(jī)體ATP能量代謝[2-3]。越來越多的證據(jù)顯示，艾灸發(fā)揮效應(yīng)與穴區(qū)局部的能量代謝存在聯(lián)系。線粒體是合成ATP，參與能量代謝的主要場所，由ATP水解反應(yīng)所釋放的生物能量可沿著蛋白質(zhì)分子進(jìn)行傳遞[4]。在此基礎(chǔ)上，選取急性胃黏膜損傷家兔模型，觀察胃黏膜損傷指數(shù)，隔藥灸對急性胃黏膜損傷家兔后三里穴區(qū)組織線粒體形態(tài)的影響以及I型膠原蛋白表達(dá)的變化，探討隔藥灸對急性胃黏膜損傷的起效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭家兔36只，體重約(2.2±0.5)kg，雌雄各18只，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。家兔購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飲食及一般情況正常者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 艾絨、動物用艾條(南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠)；硫糖鋁(四川錫成藥業(yè)有限公司，0.250g/片)；無水乙醇(上海高韻化工有限公司)；甲醛、戊二醛(上海國藥集團(tuán))；檸檬酸鈉緩沖溶液、中性樹脂(上?；鶢栴D)；I型膠原蛋白一抗、二抗(上海基免實(shí)業(yè)有限公司)；組織脫水機(jī)(TP1020型，德國徠卡公司)；石蠟包埋機(jī)(EG1160型，德國徠卡公司)；組織切片機(jī)(RM2235型，德國徠卡公司)；封片機(jī)(CV5030型，德國徠卡公司)；電子天平(PL203型，梅特勒-托利多)；制冰機(jī)(上海久景制冷設(shè)備有限公司)；不銹鋼電熱重蒸餾水器(ZLSC-5型，上海申安醫(yī)療器械廠)；電恒溫水浴槽(DK-8A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；熒光顯微鏡(BA400型，MOTIC)；Motic圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；PHILIPS CM-120透射電鏡(PHILIP)。

1.3 模型制備 采用無水乙醇灌胃的方法制備家兔急性胃黏膜損傷模型[5]。造模前各組動物均禁食48 h，造模家兔采用無水乙醇(按2.35 mL/kg)灌胃，正常組用生理鹽水(按2.35 mL/kg)灌胃，24 h后各組家兔恢復(fù)普通飲食。造模結(jié)束后，隨機(jī)選取3只急性胃黏膜損傷模型家兔和1只正常組家兔，處死后取胃黏膜進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察胃黏膜損傷情況，判斷造模成功與否。

1.4 分組與治療 采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只急性胃黏膜損傷家兔隨機(jī)分為模型組、隔藥灸組和西藥組，每組各8只，并與正常組家兔作對照。將家兔置于固定架內(nèi)固定，保持雙后腿伸出，用剃毛器將家兔左、右后肢外側(cè)“后三里”穴毛發(fā)剃除，適應(yīng)室溫10 min，按照以下方法進(jìn)行干預(yù)處理：正常組和模型組，僅做家兔固定和剃毛，不進(jìn)行任何治療；隔藥灸組，采用附子、肉桂、丹參等中藥，研成細(xì)粉，用適量黃酒調(diào)和拌成厚糊狀，采用模具壓制成直徑0.5 cm、厚0.3 cm大小的圓柱形藥餅。選取精制艾絨約90 mg，制作成小椎體狀艾柱。將制好的藥餅分別置于家兔雙側(cè)后三里穴上，上置艾柱，1次/d，每次灸6壯，連續(xù)治療7 d；西藥組，采用硫糖鋁灌胃治療。根據(jù)體表面積法計(jì)算硫糖鋁用量，1次/d，每次按25 mg/kg體重灌藥，連續(xù)治療7 d。腧穴定位方法：依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》穴位定位[6]，后三里穴位于家兔小腿背外側(cè)上1/5折點(diǎn)處，約當(dāng)脛骨嵴后1 cm，腓骨頭下1.2 cm。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 胃黏膜損傷指數(shù)評價(jià) 參考Guth法[7]進(jìn)行潰瘍指數(shù)的計(jì)分：點(diǎn)狀出血為1分；線狀出血，長度<1 mm為2分；1～2 mm為3分；2～4 mm為4分；>4 mm為5分；寬度>1 mm時(shí)分值乘以2。

1.5.2 后三里穴組織線粒體結(jié)構(gòu)觀察 取下“后三里”穴位置約0.1 cm×1 cm組織，置于2.5%戊二醛中固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋并切片，染色后由透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5.3 后三里穴組織I型膠原蛋白表達(dá)的檢測 取下“后三里”穴合適位置組織，約0.1 cm×1 cm，置于福爾馬林中固定48 h，逐級乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟、水化，置于0.01 M檸檬酸鈉緩沖溶液中95 ℃抗原修復(fù)15 min，PBS洗滌，封閉，一抗、二抗孵育，透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 匯總數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布者，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；方差齊采用LSD和SNK法，方差不齊時(shí)用Tamhane's T2或Dunnett's T3法。不符合正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胃黏膜損傷指數(shù) 與正常組相比，模型組、隔藥灸組和西藥組家兔胃黏膜損傷指數(shù)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與模型組相比，隔藥灸組和西藥組胃黏膜損傷指數(shù)均顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；隔藥灸組胃黏膜損傷指數(shù)低于西藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組家兔胃黏膜損傷指數(shù)評分比較

注：與正常組比較，**P<0.01，與模型組比較，△△P<0.01。

2.2 “后三里”穴組織線粒體結(jié)構(gòu)觀察 見圖1。

2.3 “后三里”穴組織I型膠原蛋白表達(dá)的比較 與正常組比較，模型組、隔藥灸組和西藥組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的陽性目標(biāo)總面積明顯降低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與模型組比較，隔藥灸組和西藥組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的陽性目標(biāo)總面積明顯升高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；隔藥灸組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的陽性目標(biāo)總面積略高于西藥組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，模型組和西藥組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的積分光密度明顯降低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；與模型組比較，隔藥灸組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的積分光密度明顯升高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隔藥灸組家兔“后三里”穴組織I型膠原蛋白的積分光密度略高于西藥組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖1 各組家兔“后三里”穴組織線粒體結(jié)構(gòu)觀察

組別例數(shù)陽性目標(biāo)總面積(μm2)平均光密度值正常組8969.13±24.337883.75±1295.88模型組8648.25±53.82**4688.88±474.81*隔藥灸組8816.82±132.62**★6892.50±958.37△△西藥組8747.25±51.26**△5676.38±950.46*

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

腧穴是人體臟腑經(jīng)絡(luò)氣血輸注于體表的特殊部位，是發(fā)生疾病時(shí)的反應(yīng)點(diǎn)和針灸干預(yù)的刺激點(diǎn)。足三里為足陽明胃經(jīng)之合穴，具有調(diào)理脾胃、補(bǔ)中益氣等功效，也是胃腑之下合穴，為主治胃腑病的首選穴，臨床主治與胃經(jīng)有關(guān)的疾病。中醫(yī)古籍中關(guān)于足三里治療胃脘痛的記載有很多，如：明代針灸家徐鳳在《針灸大全》記載足三里“善治胃中寒”和“合治內(nèi)府”，“肚腹三里留”又是《四總穴歌》對足三里主治作用的經(jīng)典概括，《針灸精粹》也有記載，足三里能夠“理胃病，兼治腹中一切疾病”。已有研究發(fā)現(xiàn)，艾灸足三里穴能保護(hù)胃黏膜，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)，通過抗炎(如抑制IL-1β、TNF-α等)、抗氧化、抑制凋亡等發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)胃黏膜作用[8-9]。但穴區(qū)局部的起效機(jī)制仍不明確。腧穴作為艾灸刺激的作用點(diǎn)，在施灸過程中可能發(fā)生某種改變，從而影響到艾灸效應(yīng)的發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)[10-12]，某些冠心病患者的部分腧穴(如勞宮、內(nèi)關(guān)、神門等)在一定范圍內(nèi)的紅外輻射光譜顯著低于正常人，一些潰瘍性結(jié)腸炎患者的沖陽穴在某些波長范圍內(nèi)的輻射強(qiáng)度明顯低于正常人[13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，急性胃黏膜損傷會導(dǎo)致腧穴能量代謝障礙，表現(xiàn)為線粒體結(jié)構(gòu)異常，Na+/K+-ATP酶活性降低，出現(xiàn)細(xì)胞層面線粒體功能受損為核心的能量代謝低下。纖維狀蛋白是能量傳遞和信息傳遞的重要載體，膠原纖維與經(jīng)絡(luò)現(xiàn)象中的能量傳輸有關(guān)，I型膠原蛋白可以接受紅外光譜的刺激，參與能量傳遞[14-16]。研究認(rèn)為，艾灸可產(chǎn)生0.8～5.6 μm的紅外光譜，且峰譜多數(shù)集中在1.5～3.5 μm附近，與腧穴波譜相似從而可能引發(fā)共振[17-18]。由此推論，艾灸產(chǎn)生的紅外輻射作用于穴區(qū)局部，引起局部的能量代謝的變化，表現(xiàn)為線粒體Na+/K+-ATP酶活性增強(qiáng)，這一能量變化引起蛋白質(zhì)分子比如I型膠原蛋白分子的酰胺鍵產(chǎn)生振動，使得生物能量得以沿蛋白質(zhì)分子進(jìn)行傳遞[15]，最終產(chǎn)生局部的靶器官修復(fù)效應(yīng)。綜上所述，隔藥灸能夠改善急性胃黏膜損傷家兔“后三里”穴穴區(qū)線粒體形態(tài)、提高急性胃黏膜損傷家兔后三里穴穴區(qū)組織中I型膠原蛋白的表達(dá)，提示隔藥灸修復(fù)急性胃黏膜損傷與其提高腧穴局部組織的能量代謝有關(guān)，但其能量的具體傳輸機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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(2015-05-11收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Herbs-Partitioned Moxibustion on The Point Area Mitochondria and Collagen Type I of Acute Gastric Mucosal Injury Rabbits

Zhou Zhigang1,2, Luo Weixu2, Zhang Xueqiang2, Qin Ken2, Dou Chuanzi1, Wu Huangan1

(1ShanghaiUniversityofTCM,Shanghai201203,China; 2JiangxiUniversityofTCM,Nanchang,Jiangxi330004,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on gastric mucosa injury index, the local structure of mitochondria and expression of type I collagen in acute gastric mucosal injury rabbits, and discuss the working mechanism of moxibustion on acute gastric mucosal injury from the perspective of gastric mucosal repair and energy metabolism of local acupoint. Methods: A group of New Zealand rabbits were randomly divided into normal group, model group, moxibustion group and western medicine group. As acute gastric mucosal injury model was successfully prepared, moxibustion group used ST36(Housanli) treatment, western medicine group used sucralfate gavage treatment. After the intervention, gastric mucosa and acupoint local tissue was reserved, using Guth method to observe index of gastric mucosal injury and transmission electron microscope to view local tissue mitochondrial morphology of ST36(Housanli). Also, immunohistochemistry was used to detect the expression of type I collagen. Results: Compared with the normal group, gastric mucosal injury index of rabbits in model group, western medicine group and herbs-partitioned moxibustion group were significantly increased (P<0.01). Cells in acupoint of model group appeared mitochondrial vacuolation, and expression of type I collagen was decreased (P<0.01). Besides, only a few mitochondria showed edema in moxibustion group and mitochondria decreased and mitochondrial cristae was not obvious in the western medicine group. Compared with the model group, gastric mucosal injury index decreased significantly (P<0.01), while the expression of type I collagen increased (P<0.01 orP<0.05) in moxibustion group and Western medicine group. Gastric mucosal injury index in moxibustion group was lower than that in western medicine group (P<0.01), thus type I collagen expression was higher than that in western medicine group, but the difference was not statistically significant (P>0.05). Conclusion: Herbs-partitioned moxibustion could improve mitochondrial morphology and increase the expression of collagen type I in acute gastric mucosal injury rabbits, which may be an effective approach to repair gastric mucosal injury.

Herbs-partitioned moxibustion; Acute gastric mucosal injury; Mitochondria; Collagen type I; Gastric mucosal protection

上海市教委預(yù)算內(nèi)科研項(xiàng)目(編號：2013JW53)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)資助項(xiàng)目(編號：2009CB522900)

周志剛(1971—)，男，江西蓮花縣人，博士，副教授，研究方向：灸法作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究

竇傳字(1984—)，男，山東青島人，博士，助理研究員，研究方向：針灸治療胃腸疾病，E-mail：dchuanzi@126.com；吳煥淦(1956—)，男，浙江仙居人，博士，教授，研究方向：灸法作用的基本原理與應(yīng)用規(guī)律研究，E-mail：wuhuangan@126.com

R245;R573.4

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.11.034