西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科(西安710004) 趙紅霞 高 瀅

茶多酚對(duì)缺血-再灌注大鼠p38信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡的影響*

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科(西安710004) 趙紅霞 高 瀅

目的：研究全腦缺血再灌注后茶多酚對(duì)p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白的表達(dá)及對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的影響，探討其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：126只雄性健康清潔SD大鼠隨機(jī)分為3組,缺血再灌注組(IR,n=42),假手術(shù)組(PO,n=42),茶多酚干預(yù)組(TP,n=42)。經(jīng)典四血管阻塞法建立全腦缺血再灌注損傷模型, TP組給予腹腔注射茶多酚200 mg/kg,時(shí)間在全腦缺血再灌注結(jié)束之后，其余兩組則給予等劑量生理鹽水腹腔注入。各組均在再灌注后2、6、12、24、48、72h 處死大鼠,提取腦組織制備病理切片,免疫組化染色觀察磷酸化p38蛋白的表達(dá)；HE染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；TUNEL染色計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果：腦缺血再灌注損傷后凋亡細(xì)胞在海馬CA1區(qū)PO組少量表達(dá),IR組顯著表達(dá)(P<0.05),TP組凋亡細(xì)胞表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)介于IR組和PO組之間(P<0.05)；與PO組比較,IR組在再灌注后各時(shí)點(diǎn)p38蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05),TP組較PO組表達(dá)增強(qiáng)但較IR組表達(dá)減弱(P<0.05)。結(jié)論：茶多酚可抑制大鼠全腦缺血/再灌注損傷時(shí)的p38蛋白活性,進(jìn)而減少海馬椎體細(xì)胞凋亡,對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡等一系列病理生理過(guò)程[1]。MAPK家族主要包括ERK,p38MAPK和JNK通路3個(gè)主要成員。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,活化的磷酸化p38蛋白參與了機(jī)體免疫與應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中的細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡發(fā)生后及時(shí)干預(yù)可明顯減少由腦缺血后再灌注形成的繼發(fā)損傷所致的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。茶多酚(Tea-polyphenols,TP)是由綠茶中提取的具有超強(qiáng)抗氧化劑作用的物質(zhì),具有較強(qiáng)的清除人體自由基、抗癌、抗輻射、穩(wěn)定心血管系統(tǒng)功能等作用[2]。本研究探索在臨床麻醉手術(shù)中常見的腦缺血再灌注損傷后茶多酚對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,為臨床研究腦保護(hù)及保護(hù)機(jī)制提供幫助。

材料與方法

1 材 料 雄性清潔級(jí) Sprague-Dawley 大鼠126只,鼠齡55～65d,體重250±30g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下飼養(yǎng)1周,術(shù)前禁食12h。茶多酚(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司),原位末端標(biāo)記細(xì)胞凋亡試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Promega公司),SABC免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒和p38磷酸化抗兔多克隆抗體(由北京博奧森生物科技有限公司提供)。

2 方 法 ①動(dòng)物分組：126只Sprague-Dawley 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(PO組)，缺血/再灌注組(IR組)和茶多酚治療組(TP組)。各組均按再灌注時(shí)間點(diǎn)的不同分為2h、6h、12h、24h、48h和72h 6個(gè)亞組,每個(gè)亞組7只動(dòng)物。②模型制作及取材：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用經(jīng)典4-VO法建立全腦缺血/再灌注損傷模型。手術(shù)第1日,IR組及TP組先用微電凝將雙側(cè)椎動(dòng)脈凝斷,縫合傷口后放入籠中；第2日,分離第1日凝斷椎動(dòng)脈大鼠的頸總動(dòng)脈,然后用微動(dòng)脈夾將雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉6min,頸總動(dòng)脈夾閉后在實(shí)驗(yàn)光源下觀察到大鼠瞳孔散大、嘴唇發(fā)紺、呼吸急促、眼球蒼白等變化。若在頸總動(dòng)脈夾閉2min內(nèi)瞳孔不散大者予以剔除,不計(jì)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)，然后重新納入新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同前方法造模，歸入剔除的組內(nèi)。PO組模型制作時(shí)僅暴露出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的頸總動(dòng)脈及椎動(dòng)脈,不凝斷椎動(dòng)脈和夾閉頸總動(dòng)脈。再灌注結(jié)束后TP組給予腹腔注射茶多酚200mg/kg,其余各組注射等量的生理鹽水。③HE染色及免疫組織化學(xué)SABC法染色：見參考文獻(xiàn)[3]。④TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：見參考文獻(xiàn)[4]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HE染色 見圖1。PO組海馬CA1區(qū)約有3～4層椎體細(xì)胞,排列整齊,胞質(zhì)淡紅,胞核藍(lán)染,核仁清晰。IR組鏡下可見神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,細(xì)胞漿呈嗜酸性變、細(xì)胞體深染、細(xì)胞膜及核膜皺縮、細(xì)胞核仁消失。而TP組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目較缺血再灌注組多，較假手術(shù)組為少，且細(xì)胞形態(tài)改變較輕，正常神經(jīng)元與缺血損傷后神經(jīng)元交錯(cuò)分布。

2 磷酸化p38蛋白免疫組化結(jié)果 見圖2，表1。鏡下觀察切片,在腦缺血再灌注敏感區(qū)磷酸化p38蛋白的表達(dá)在各組不同，且與再灌注損傷時(shí)間相關(guān)。在PO組，表達(dá)不明顯，棕褐色陽(yáng)性細(xì)胞較少，IR組棕褐色陽(yáng)性磷酸化p38蛋白表達(dá)呈一定規(guī)律，即在再灌注結(jié)束后的2h開始微量表達(dá),隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)較之前更明顯，到再灌注后48～72h時(shí)，褐色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多，染色最明顯，當(dāng)達(dá)到頂峰后開始出現(xiàn)下降,這一結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而茶多酚干預(yù)后，TP組各時(shí)間點(diǎn)褐色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較PO組多而較IR少(P<0.05)。

表1 茶多酚治療后各時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)磷酸化p38蛋白陽(yáng)性細(xì)胞率比較 ±s)

注：與PO組相比，★P<0.05；與IR組相比，▲P<0.05

3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果 見圖3,表2。檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，凋亡細(xì)胞在各組分布不同，最多表達(dá)于IR組，且隨著再灌注時(shí)間的不同，凋亡細(xì)胞表達(dá)呈先升高至高峰后又開始下降，高峰時(shí)間在再灌注后48h，凋亡細(xì)胞表達(dá)最少在PO組，而TP組凋亡細(xì)胞的表達(dá)介于IR組和PO組之間。

表2 茶多酚治療后各時(shí)點(diǎn)海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞凋亡指數(shù)比較±s)

注：與PO組相比,★P<0.05；與IR組相比,▲P<0.05

討 論

眾所周知,腦缺血/再灌注損傷后細(xì)胞死亡主要有壞死和凋亡兩種形式,而壞死的發(fā)生較早,且呈瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng),因此,對(duì)于研究著來(lái)講似乎無(wú)法干預(yù)，而凋亡的發(fā)生則較壞死發(fā)生滯后[5]。既往研究資料顯示，在腦缺血再灌注后2～4d都可以觀察到凋亡的發(fā)生,因此，針對(duì)凋亡的干預(yù)應(yīng)該成為臨床研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠全腦缺血2～4h后,p38活性開始增高,3～4d后達(dá)到峰值。同時(shí),細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示：腦缺血/再灌注損傷后，凋亡細(xì)胞在6h開始增多，24～48h達(dá)到高峰,72h開始下降。二者的發(fā)生在時(shí)間上具有一致性，且p38蛋白含量的高低與細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)。這一結(jié)果表明,p38MAPK通路在腦缺血/再灌注損傷中起重要作用,即在細(xì)胞凋亡的早期即被激活而誘導(dǎo)和加重細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

茶多酚是一種強(qiáng)效的天然抗氧化劑,具有降壓、降脂、抗氧化等臨床作用,在人群免疫及保健方面發(fā)揮重要作用,本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),茶多酚在全腦缺血再灌注損傷后抑制細(xì)胞凋亡方面起重要作用，其抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能主要與抑制細(xì)胞膜上的海人藻酸受體和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體所介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)[6]。其次,茶多酚有強(qiáng)大的抗氧化作用,可以清除細(xì)胞內(nèi)所產(chǎn)生的氧自由基[7]。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，得出以下結(jié)論：茶多酚可以通過(guò)多種作用機(jī)制改善腦缺血/再灌注后所致的細(xì)胞損傷，減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其中，最可能的機(jī)制則與抑制p38MAPK通路的活性相關(guān)，從而為臨床治療常見的休克，呼吸心跳驟停等提供新的思路。但基于目前的研究現(xiàn)狀，還無(wú)法達(dá)到這一目的，期待在今后的研究中有更佳的發(fā)現(xiàn)。

[1] 粟建新.茶多酚分對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8(1)：236-237.

[2] 李 軍，辛 勤，楊 雁.綠茶多酚藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14(1)：128-130.

[3] 王 智,薛榮亮,趙紅霞,等.姜黃素對(duì)缺血/再灌注損傷大鼠APE/Ref-1表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響[J].山東醫(yī)學(xué)雜志,2013,37：1-4.

[4] 王 智,薛榮亮,趙紅霞,等.依達(dá)拉奉對(duì)大鼠XRCC1和細(xì)胞凋亡的影響[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2012,15(9)：537-540.

[5] 趙保路.茶多酚保護(hù)腦神經(jīng)防止帕金森病損傷作用及其分子機(jī)理[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008, 35(7)：735-743.

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[7] 薜榮亮，紀(jì) 娜，高 靜，等.茶多酚對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2011，31(9)：1117-1119．

(收稿：2014-10-13)

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30571790)

腦 再灌注損傷 細(xì)胞凋亡 p38有絲分裂原激活蛋白激酶 @茶多酚

R743.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.005