武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院(西安710054) 曹 艷 何利紅 孫 赟 于 泳

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黃芪甲苷對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901侵襲能力的影響及其機(jī)制探討

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院(西安710054) 曹 艷 何利紅▲孫 赟 于 泳

目的：研究黃芪甲苷對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901侵襲能力的影響并探討其可能的機(jī)制。方法：用終濃度為100μg /ml黃芪甲苷處理實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞48h，之后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡情況,Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響,并采用PCR和Western-blot方法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響,最后采用Western-blot方法檢測(cè)黃芪甲苷處理對(duì)細(xì)胞ERK通路的活化情況的影響。結(jié)果：100μg/ml黃芪甲苷處理胃癌細(xì)胞SGC7901 48h后,細(xì)胞凋亡比例未發(fā)生明顯變化,細(xì)胞侵襲能力顯著降低,MMP-2和MMP-9分子的mRNA和蛋白水平均下降,此外,細(xì)胞內(nèi)的磷酸化ERK蛋白水平在黃芪甲苷處理后表達(dá)減少。結(jié)論：在體外黃芪甲苷能夠通過減少細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)而發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞侵襲的能力，而且其抑侵襲作用一定程度上是通過抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一,由于胃癌的高侵襲轉(zhuǎn)移特性,傳統(tǒng)的治療方法如外科手術(shù)、化療和放療等對(duì)其治療效果有限。黃芪是常用的一種扶正益氣類中藥，含有許多藥理成分,具有比較廣泛的藥理作用[1]。黃芪甲苷(A-IV)是黃芪的主要活性成分之一,研究發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)體外均具有抗腫瘤作用[2]。最近的研究也表明,黃芪甲苷能夠抑制包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,但其機(jī)制仍不清楚[3-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討黃芪甲苷對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901侵襲能力的影響,并進(jìn)一步研究其機(jī)制,為黃芪甲苷在臨床抗腫瘤中的應(yīng)用提供新的依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 ①細(xì)胞培養(yǎng)與分組：胃癌細(xì)胞株SGC7901置于含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化并傳代。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組加入不含黃芪甲苷的DMSO溶劑,實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為100μg/ml的黃芪甲苷培養(yǎng)液。②主要試劑：黃芪甲苷(純度>98%)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司,并根據(jù)說明書對(duì)藥物進(jìn)行合適的溶解并保存，使用時(shí)稀釋至相應(yīng)濃度；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin-V和PI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗MMP-2、MMP-9、ERK、p-ERK、β-actin一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；MMP-2、MMP-9和β-actin引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)并合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

2 方 法 ①流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組SGC7901細(xì)胞經(jīng)處理48h后,常規(guī)胰酶消化兩組細(xì)胞,離心,PBS洗3次,再用200μl PBS重懸于EP管中,加入5μl Annexin V-FITC避光孵育10min,之后再加入 10μl PI避光孵育10min,冰上運(yùn)輸,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例,激發(fā)光分別為488nm和530nm。②Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前,先更換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞過夜,次日以胰蛋白酶消化細(xì)胞,重懸后計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml；將Matrigel包被的Transwell小室放置在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),向Transwell小室中加入兩組SGC7901細(xì)胞懸液100μl(1×105個(gè)/孔),將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,培養(yǎng)結(jié)束后取出小室,PBS洗2遍,用棉簽小心擦拭小室內(nèi)細(xì)胞,將小室置于95%乙醇中固定5min,用PBS配置0.5%結(jié)晶紫溶液,在搖床上室溫下?lián)u晃染色30min，染色完畢后PBS洗2次,靜置干燥后倒置顯微鏡下觀察,100倍光鏡下隨機(jī)選取多個(gè)視野對(duì)視野下的的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。③實(shí)時(shí)定量PCR：細(xì)胞處理完成后,Trizol裂解未干預(yù)組和干預(yù)組細(xì)胞并提取總RNA,后按照說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。所有基因引物均由上海生工生物公司設(shè)計(jì)并且合成。β-actin上游引物：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’,下游引物：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’；MMP-2上游引物：5’-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3’,下游引物：5’- TTCAGGTAATAGGCACCCTFGAAGA-3’；MMP-9上游引物：5’-ACGCACGACGTCTFCCAGTA-3’，下游引物：5’-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3’；PCR反應(yīng)體系為25μl，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min，95℃ 變性5s，58℃退火延伸 30s，擴(kuò)增進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，之后建立溶解曲線。每個(gè)反應(yīng)孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔,反應(yīng)在Bio-Rad IQ5熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，并采用儀器自帶分析軟件,運(yùn)用2-ΔΔCT法分析基因相對(duì)表達(dá)量,以β-actin作為內(nèi)參照。④Western-blot：SGC7901細(xì)胞經(jīng)黃芪甲苷100μg/ml干預(yù)處理48h后,分別提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白,使用BCA法檢測(cè)所提取蛋白的濃度,每孔蛋白上樣量約30μg,經(jīng)8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后,轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶或3%牛血清白蛋白室溫封閉1h,將相應(yīng)的一抗根據(jù)說明書按照推薦比例稀釋后,4℃搖晃孵育PVDF膜過夜,次日用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋后室溫下孵育PVDF膜1h,最后采用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶,并用Gel Image System 軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,結(jié)果以目標(biāo)蛋白分別與β-肌動(dòng)蛋白的比值表示。

結(jié) 果

1 黃芪甲苷對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響 當(dāng)100μg/ml黃芪甲苷處理SGC7901胃癌細(xì)胞48h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡的影響，通過3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡比例分別為4.1±0.8%、3.7±0.9%，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說明黃芪甲苷對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響,見圖1。

圖1 100μg/ml黃芪甲苷處理48h對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡的影響

2 黃芪甲苷抑制SGC7901細(xì)胞侵襲能力 在黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞凋亡不產(chǎn)生影響的前提下，通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖2A)；通過對(duì)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中所選取的隨機(jī)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞的侵襲能力存在差異(P<0.05，圖2B)。

3 黃芪甲苷對(duì)SGC7901細(xì)胞MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響 由于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的重要因素。而這其中，MMP-2和MMP-9是降解腫瘤基質(zhì)膜的最重要成分。因此，我們通過PCR和Western-blot檢測(cè)了黃芪甲苷對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響,結(jié)果顯示：無(wú)論是mRNA水平(圖3A)還是蛋白水平(圖3B)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)均受到抑制(P<0.05)。提示黃芪甲苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的抑制部分是通過抑制了細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)而引起的。

4 黃芪甲苷對(duì)SGC7901細(xì)胞ERK通路的影響 研究表明MMP-2和MMP-9的表達(dá)受多種信號(hào)通路的調(diào)控,而ERK通路是調(diào)控MMP-2和MMP-9的關(guān)鍵信號(hào)通路之一[5]。我們假設(shè)黃芪甲苷通過該通路引起了MMP-2和MMP-9的表達(dá)變化,為驗(yàn)證該通路是否參與了黃芪甲苷引起的胃癌細(xì)胞侵襲能力降低,采用Western-blot的方法檢測(cè)了黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞ERK通路的影響。如圖4所示，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，總ERK蛋白并無(wú)明顯變化，而其磷酸化狀態(tài)(p-ERK)在實(shí)驗(yàn)組中明顯降低,說明黃芪甲苷抑制了ERK蛋白的活化。

圖2 100μg/ml黃芪甲苷處理48h對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901侵襲能力的影響(×100)

圖3 100μg/ml黃芪甲苷處理48h對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9mRNA蛋白表達(dá)的影響

圖4 100μg/ml黃芪甲苷處理48h對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞ERK通路的影響

討 論

自從黃芪甲苷的抗腫瘤效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，黃芪已被當(dāng)作多種腫瘤的有效治療手段之一。近幾年來(lái)，對(duì)黃芪甲苷抗腫瘤機(jī)制的深入研究表明,黃芪甲苷能夠通過調(diào)節(jié)免疫功能、抑制細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抗腫瘤血管生成等方面從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。同時(shí),也有研究表明黃芪能夠抑制高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC97-H、和胃癌細(xì)胞MKN-74和MKN-45的侵襲轉(zhuǎn)移能力[6]。提示了黃芪在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面也具有一定作用。細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟過程，有多種分子參與其中。已有初步發(fā)現(xiàn)黃芪的抗侵襲作用很有可能是通過抑制細(xì)胞COX-2、VEGF、MMP-2等的表達(dá)而引起的[7]。但是黃芪通過何種機(jī)制調(diào)控著這些侵襲促進(jìn)分子,仍不清楚。由于MMPs家族是降解腫瘤基質(zhì)膜，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的必要前提，因此我們檢測(cè)了黃芪甲苷處理胃癌細(xì)胞后MMP-2和MMP-9的表達(dá)變化，我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞接受黃芪甲苷處理48h之后，兩者的表達(dá)無(wú)論在mRNA還是蛋白水平都發(fā)生了下調(diào)，這與其他學(xué)者在肝癌中的報(bào)道一致[8]。同時(shí)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示黃芪甲苷處理后，細(xì)胞未發(fā)生明顯凋亡比例的增加,排除了其對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡而引起的。進(jìn)一步，我們通過檢測(cè)有可能參與調(diào)控MMP-2和MMP-9的上游信號(hào)通路的激活情況,我們發(fā)現(xiàn)ERK通路在黃芪甲苷處理后，其激活情況被抑制。ERK通路是已知的調(diào)控細(xì)胞MMPs分泌的重要上游開關(guān)[5-6]。因此我們的結(jié)果說明了黃芪甲苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用很有可能是通過ERK通路而實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)作為調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的分子開關(guān)，ERK在多種腫瘤組織中均存在過度激活的狀態(tài),而體外試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),黃芪甲苷對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用[3]。因此,我們推測(cè)黃芪甲苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑增殖作用也有可能通過ERK通路而實(shí)現(xiàn)，但是仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。由此可見，黃芪甲苷有可能通過多種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮著抗腫瘤作用，需要我們對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步地發(fā)掘和驗(yàn)證，才能為其在臨床上的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在體外通過研究黃芪甲苷對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC7901侵襲能力的影響，證明了黃芪甲苷的抗腫瘤侵襲作用。并驗(yàn)證了其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響是部分通過抑制細(xì)胞MMP-2和MMP-9的分泌而實(shí)現(xiàn)的，除此之外，本研究首次報(bào)道了黃芪甲苷能夠通過抑制ERK通路而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的降低，為黃芪甲苷在臨床中的廣泛應(yīng)用提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(收稿：2014-10-16)

The anti-invasion effects of astragaloside IV on gastric cancer cell line SGC7901 and its related mechanism

Shaanxi Provincial Corps Hospital of the Chinese People’s Armed Police Force(Xi’an 710054)

Cao Yan He Lihong Sun Yun et al

Objective：To investigate the effects of astragaloside IV on the invasive capacity of gastric cancer cell line SGC7901 and to explore the potential mechanisms involved. Methods：The SGC7901 cell was treated with or without 100μg/ml astragaloside IV for 48h.After astragaloside IV administration,the apoptotic cells between the control group and the experimental group were detected by flow cytometry,the invasive capacity was measured by transwell invasion assay,the expression of MMP-2 and MMP-9 was leveled by PCR and Western-blot. Finally, the status of the ERK pathway was analyzed by Western-blot to further elucidate the impact of astragaloside IV on SGC7901 cells.Results：After being treated with or without 100μg/ml astragaloside IV for 48h, the SGC7901 cell possessed non-significant proportion of apoptosis.The invasive capacity,the MMP-2 and the MMP-9 expression were obviously impaired after astragaloside IV treatment. Besides,Western-blot assay showed that the phosphorylation of ERK was decreased in the experimental group. Conclusion：Astragaloside IV can inhibit the invasive capacity of gastric cancer cells through diminishing the MMP-2 and the MMP-9 expression. And the anti-invasion effects of astragaloside IV is possibly mediated by inactivating the ERK pathway.

Astragaloside IV Gastric neoplasms Neoplasm metastasis Matrix metalloproteinases @ERK

黃芪甲苷 胃腫瘤 腫瘤轉(zhuǎn)移 基質(zhì)金屬蛋白酶 @細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.006