李 猛 周素明 劉 璐 彭 頔 王國(guó)良

(寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

文蛤(Meretrix meretrix)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchiata)、簾蛤目(Veneroida)、簾蛤科(Veneridae)、文蛤?qū)?Meretrix)。具有很高的食用和藥用價(jià)值, 廣泛分布于山東、江蘇、廣西、浙江等沿海地區(qū)。近年來(lái), 由于養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大, 環(huán)境惡化, 管理方法不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致病害滋生, 嚴(yán)重阻礙了文蛤養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。為提高文蛤的抗病害能力, 有必要對(duì)其免疫相關(guān)因子進(jìn)行深入研究。

凝集素是一類可結(jié)合糖類物質(zhì)的蛋白, 最初于植物中發(fā)現(xiàn), 在細(xì)菌、真菌和動(dòng)物中同樣大量存在。凝集素在多種生命過(guò)程包括細(xì)胞間通信、蛋白的折疊和裝配、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非己識(shí)別等中發(fā)揮著重要作用(Vastaet al, 2004)。根據(jù)凝集素糖類識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD的結(jié)構(gòu)特征不同, 可將凝集素分為 C-、L-、P-、I-、R-和 S-型凝集素等(Janewayet al, 2002)。C-型凝集素家族是目前研究最多的一類凝集素, 其主要特征是在蛋白質(zhì)分子的 C末端含有糖識(shí)別的結(jié)構(gòu)域 CRD,具有保守特征性功能域, 其凝集活性具有鈣離子依賴性(羅展等, 2010)。貝類動(dòng)物的免疫機(jī)制以非特異性免疫為主, 其中 C-型凝集素作為可與糖專一性結(jié)合并能促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白, 在免疫識(shí)別和防御系統(tǒng)中專一地與異物表面特定的糖基結(jié)合,從而吸附和凝集異物, 促進(jìn)機(jī)體清除和殺滅異物(Tamplinet al, 1989)。目前, 已經(jīng)在櫛孔扇貝(Chlamys farreri)(Wanget al, 2007; Zhanget al, 2009a)、海灣扇貝(Argopecten irradians)(Zhuet al, 2008)、合浦珠母貝(Pinctada fucata)(胡鈺婷等, 2011)、刺參(Apostichopus japonicus) (Hanet al, 2012)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)(Zhanget al, 2009b)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(于金紅等, 2013)等不同海洋動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并克隆獲得 C-型凝集素基因的全長(zhǎng)序列, 但在文蛤中對(duì) C-型凝集素的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)成功獲得了文蛤 C-型凝集素基因的 cDNA全序列, 明確了它的序列特征、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其對(duì)環(huán)境因子脅迫影響的表達(dá)變化, 為進(jìn)一步深入研究文蛤 C-型凝集素的免疫功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

文蛤采樣于溫州市龍灣區(qū)文蛤養(yǎng)殖場(chǎng), 選擇殼色正常、無(wú)異味, 健康無(wú)發(fā)病癥狀的文蛤于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3天后進(jìn)行試驗(yàn)。大腸桿菌E.coliTG1和溶藻弧菌菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存, 連接載體 pMD18T購(gòu)于TaKaRa公司。

TRizol總 RNA 提取試劑盒(Invitrogen), 3￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase (TaKaRa),5￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase(TaKaRa), PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthseis Kit (TaKaRa), GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。PCR儀(Bio-Rad), 微量核酸蛋白測(cè)定儀(Bio-Rad), 冷凍離心機(jī)(Eppendorf),凝膠成像儀(Bio-Rad)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已有的貝類C-型凝集素基因序列, 設(shè)計(jì)克隆及定量PCR所需引物(表1, 表2)。

表1 文蛤C-型凝集素基因克隆所用引物及序列Tab. 1 Primers used to clone the C-type lectin gene of M. meretrix

1.3 文蛤總RNA提取及cDNA第一鏈合成

挑選三只健康文蛤并取肝胰腺組織 20—50mg,采用RNA提取試劑盒(Trizol Reagent, Invitrogen)提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthseis Kit, TaKaRa)將之反轉(zhuǎn)錄成cDNA,37 °C反轉(zhuǎn)錄15min, 85°C 5s。合成的cDNA產(chǎn)物于–20°C保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4 文蛤C-型凝集素基因克隆

根據(jù)文蛤C-型凝集素基因(Mm-CTL)的EST序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物CTL-R1和CTL-F1(表1), 以cDNA為模板 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系: 超純水 15.7μL, cDNA 1.0μL, 10×PCR buffer 2.5μL, MgCl21.5μL, dNTP 2.0μL, CTL-R1 1.0μL, CTL-F1 1.0μL, rTaq 0.3μL。反應(yīng)條件: 94°C 5min, 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 40s, 共35個(gè)循環(huán), 72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳后, 利用 GenClean 柱式瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收目的條帶, 與 pMD18T載體連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TG1中, PCR檢測(cè)正確并送至上海英駿生物公司測(cè)序。

根據(jù)所得序列分別設(shè)計(jì)3￠RACE和5￠RACE引物(表 1), 按照 3￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒和 5￠-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳確認(rèn), 并將出現(xiàn)的條帶割膠回收, 回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化, PCR檢測(cè)正確并送樣測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

將拼接后的 Mm-CTL進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用 NCBI 的 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)程序?qū)λ眯蛄凶鏖_(kāi)放閱讀框分析, 預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列, 同時(shí)利用 Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白的功能域。使用 NCBI的blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行氨基酸同源性分析, 用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 感染及環(huán)境脅迫實(shí)驗(yàn)

制備濃度為107cells/mL的溶藻弧菌菌懸液, 取菌懸液以 1︰100的比例與過(guò)濾海水稀釋后, 將文蛤放入其中浸染, 對(duì)照組采用過(guò)濾后海水, 鹽度 20, 溫度25°C。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組同步取樣, 分別在0h、6h、12h、24h、48h、72h隨機(jī)選取每組三只文蛤提取肝胰腺RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

將健康的文蛤隨機(jī)分成6組, 分別放在鹽度為5、10、15、20、25、30的海水中 25°C 培養(yǎng), 12h后每組隨機(jī)選取3只文蛤提取肝胰腺RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

將健康的文蛤隨機(jī)分成6組, 分別放在溫度分別為 10、15、20、25、30、35°C 的海水中(鹽度 20)培養(yǎng), 12h后每組隨機(jī)選取 3只文蛤提取肝胰腺 RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

分別以上述所制備的 cDNA 為模板, 以 P-β-ACTIN-F、P-β-ACTIN-R、P-C-F、P-C-R (表 2)為引物進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因β-actin的RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系同上。目的基因擴(kuò)增條件為94°C 5min, 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 共 35 個(gè)循環(huán), 72°C 延伸10min。內(nèi)參基因擴(kuò)增條件為 94°C 5min, 94°C 30s,56°C 30s, 72°C 30s, 共 28 個(gè)循環(huán), 72°C 延伸 10min。反應(yīng)重復(fù)三次 RT-PCR。將 PCR結(jié)果用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 在凝膠成像儀下成像。

2 結(jié)果

2.1 文蛤C-型凝集素的基因克隆與生物信息學(xué)分析

通過(guò)PCR和RACE技術(shù)獲得Mm-CTL核心序列和3￠端與 5￠端序列, 經(jīng)過(guò)拼接該基因的全長(zhǎng)為 1855bp(GenBank序列號(hào): JX232217), 其開(kāi)放閱讀框?yàn)?19bp,編碼172個(gè)氨基酸(圖1)。利用Smart軟件預(yù)測(cè)蛋白的功能域(圖1, 圖2)。結(jié)果顯示, 第34個(gè)蛋白到168個(gè)蛋白為 Mm-CTL的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD), 該 CRD 含有的參與二硫鍵形成的 6個(gè)保守的半胱氨酸, 分別位于 Cys34、Cys47、Cys64、Cys143、Cys159、Cys167。在CRD區(qū)域中找到?jīng)Q定糖結(jié)合的特異性序列“EPN”。

圖1 文蛤C-型凝集素基因cDNA序列Fig.1 cDNA sequences of C-lectin gene in M. meretrix陰影表示CRD, 曲線下劃線表示決定糖結(jié)合特異性的序列(EPN)

圖2 C-型凝集素預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domain analysis on putative C-lectin protein

將拼接后的序列進(jìn)行同源性比對(duì), 結(jié)果顯示與日本刺參(Apostichopus japonicus), 青鳉(Oryzias latipes),中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis), 日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus), 長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas),大竹蟶(Solen grandis)相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列相似性分別為 13.5%、13.5%、21.5%、23.2%、23.9%、56.5%(圖 3)。

利用MEGA4.1軟件對(duì)Mm-CTL進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù), 用 N-J方法進(jìn)行聚類分析。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示(圖 4), 不同物種的凝集素各自成簇, 脊椎動(dòng)物聚在一類, 無(wú)脊椎動(dòng)物聚在一類。從文蛤體內(nèi)獲得的Mm-CTL與大竹蟶(Solen grandis)聚類在一起,與長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)進(jìn)化距離較近。

2.2 環(huán)境因子對(duì)文蛤C-型凝集素基因表達(dá)量變化的影響

2.2.1 弧菌感染對(duì)文蛤體內(nèi) C-型凝集素基因表達(dá)量的影響 在溶藻弧菌刺激下, 文蛤肝胰腺 Mm-CTL表達(dá)量變化結(jié)果見(jiàn)圖5。溶藻弧菌感染6h時(shí)表達(dá)量明顯上升, 在12h時(shí)達(dá)到最高值, 隨后有所下降,72h時(shí)趨于穩(wěn)定并與對(duì)照組無(wú)明顯差異。

2.2.2 鹽度變化對(duì)文蛤體內(nèi) C-型凝集素基因表達(dá)量的影響 在不同鹽度脅迫下, 文蛤肝胰腺 Mm-CTL表達(dá)量變化結(jié)果見(jiàn)圖 6。在鹽度 5時(shí) Mm-CTL表達(dá)量比較低, 在鹽度10—20范圍時(shí)Mm-CTL表達(dá)量相對(duì)較高, 當(dāng)鹽度高于20時(shí), Mm-CTL的表達(dá)量反而較低。

2.2.3 溫度變化對(duì)文蛤體內(nèi) C-型凝集素基因表達(dá)量的影響 在不同溫度脅迫下, 文蛤肝胰腺 Mm-CTL表達(dá)量變化結(jié)果見(jiàn)圖7。在水溫25°C以上時(shí), 隨著水溫的上升表達(dá)量明顯上升, 水溫 25°C以下時(shí),隨著溫度下降表達(dá)量明顯下降。35°C時(shí)表達(dá)量相對(duì)最高, 10°C時(shí)表達(dá)量明顯較低。

圖3 文蛤C-型凝集素氨基酸序列與其它物種凝集素氨基酸序列的比對(duì)Fig.3 Multiple alignments of amino acid sequence of C-lectin of M. meretrix with other known species genes黑色背景表示相同的氨基酸, 灰色背景表示性質(zhì)相似的氨基酸

圖4 不同物種凝集素氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The evolutionary tree of lectin amino acid sequence of different species

3 討論

C-型凝集素是一類鈣離子依賴活性的糖蛋白,包含至少一個(gè)保守的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域(陳政良, 1997),低等生物的 C-型凝集素基因一般只有一個(gè) CRD, 而其它物種則有的兩個(gè)或多個(gè)CRD (Songet al, 2010)。對(duì)于蝦類而言, 日本囊對(duì)蝦已報(bào)道的 C-型凝集素基因中均只含 1個(gè) CRD結(jié)構(gòu)域, 羅氏沼蝦已報(bào)道的 4個(gè)C-型凝集素基因中都含2個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域(Renet al,2012)。中國(guó)明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦則存在C-型凝集素基因中既有包含1個(gè)CRD的又有含2個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域的情況(Liuet al, 2007; Sunet al, 2008; Weiet al,2012)。合浦珠母貝和櫛孔扇貝 C-型凝集素基因中也都包含1個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域(胡鈺婷等, 2011)。本研究中克隆獲得的文蛤 C-型凝集素基因和合浦珠母貝和櫛孔扇貝相似, 只含1個(gè)CRD結(jié)構(gòu)域。CRD結(jié)構(gòu)域中,主要由 2個(gè)基序與鈣離子共同作用完成對(duì)糖基分子的結(jié)合, 第一個(gè)典型的基序?yàn)?EPN或 QPD, 第二個(gè)典型的基序?yàn)閃ND。EPN可對(duì)甘露糖進(jìn)行識(shí)別, QPD則可識(shí)別半乳糖(Drickamer, 1992; Kolatkaret al,1996)。本研究顯示, 文蛤 C-型凝集素基因糖基結(jié)合位點(diǎn)為 EPN, 表明文蛤 C-型凝集素可能對(duì)甘露糖進(jìn)行識(shí)別并結(jié)合。

圖5 文蛤肝胰腺C-型凝集素在溶藻弧菌刺激后的RT-PCR電泳圖Fig.5 RT-PCR electrophoregrams of C-lectin gene in hemocytes of M. meretrix after V. alginolyticus challenge

圖6 文蛤肝胰腺C-型凝集素基因在不同鹽度刺激后的RT-PCR電泳圖譜Fig.6 RT-PCR electrophoregrams of C-lectin gene in hemocytes of M. meretrix in different salinities

圖7 文蛤肝胰腺C-型凝集素基因在不同溫度刺激后的RT-PCR電泳圖譜Fig.7 RT-PCR electrophoregrams of C-lectin gene in hemocytes in M. meretrix in different temperatures

貝類具有非特異免疫系統(tǒng), 免疫系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單,易受外界脅迫影響。在通過(guò)先天免疫對(duì)病原菌感染的應(yīng)答過(guò)程中, C-型凝集素扮演著重要的作用(Willmentet al, 2008)。吳彪等(2013)用鰻弧菌感染蝦夷扇貝后4h表達(dá)量顯著上升, 8h達(dá)到最高峰, 隨后下降, 16h后與對(duì)照基本無(wú)差異。胡鈺婷等(2011)在合浦珠母貝C-型凝集素基因研究中, 用溶藻弧菌刺激后的 4h至24 h表達(dá)量顯著上調(diào)。本實(shí)驗(yàn)用溶藻弧菌感染文蛤,Mm-CTL在6h時(shí)表達(dá)量明顯上升, 在12h時(shí)達(dá)到最高值, 隨后有所下降, 72h時(shí)趨于穩(wěn)定。說(shuō)明Mm-CTL的表達(dá)量可受微生物刺激而誘導(dǎo), 也表明 Mm-CTL參與對(duì)微生物入侵的免疫應(yīng)答, 有助于提高文蛤的免疫防御能力。

溫度和鹽度是影響貝類生長(zhǎng), 攝食, 免疫應(yīng)答等非常重要的環(huán)境因子(Kimet al, 2009)。有研究表明, 貝類病害的爆發(fā)與鹽度的變化有直接的關(guān)系, 這可能與鹽度脅迫導(dǎo)致貝類免疫能力下降有關(guān)。Cheng等(2004)研究鹽度對(duì)雜色鮑(Haliotis diversicolor supertexta)免疫能力的影響表明, 當(dāng)雜色鮑由鹽度 30的環(huán)境, 轉(zhuǎn)移到鹽度20、25和35的環(huán)境中時(shí), 其血細(xì)胞數(shù)量減少,酚氧化酶活力、吞噬活力、呼吸爆破活力和清除副溶血弧菌的能力降低, 雜色鮑容易受到致病菌的侵襲而死亡。鹽度變化不僅可以通過(guò)影響免疫因子活力的方式來(lái)影響機(jī)體的免疫能力, 還可以通過(guò)影響免疫因子表達(dá)量變化來(lái)影響機(jī)體免疫能力。本實(shí)驗(yàn)在研究不同鹽度對(duì) Mm-CTL表達(dá)量變化時(shí)發(fā)現(xiàn), 鹽度 10、15和20時(shí)Mm-CTL的表達(dá)量相對(duì)較高。表明鹽度在一定的變化幅度內(nèi)能誘導(dǎo) Mm-CTL的表達(dá), 起免疫保護(hù)作用, 但超出一定范圍則免疫功能將受到抑制。

Dang等(2012)的研究發(fā)現(xiàn)歐洲鮑螺(Haliotisrubra)在水溫由 18°C升至 21°C和 24°C時(shí), 其抗菌活力和抗病毒活力上升, 但長(zhǎng)時(shí)間脅迫, 會(huì)導(dǎo)致歐洲鮑螺抗菌活力和抗病毒活力受到抑制。李曉英等(2009)對(duì)青蛤(Cyclina sinensis)的研究表明, 短時(shí)間內(nèi), 溫度驟升能提升青蛤超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活力, 但長(zhǎng)時(shí)間的高溫刺激, 反而會(huì)抑制兩種酶活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在溫度高于25°C時(shí), Mm-CTL的表達(dá)量隨溫度升高明顯上升, 表明溫度的變化可以誘導(dǎo)文蛤免疫因子的表達(dá), 從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究從文蛤中克隆到一種 C-型凝集素的基因,通過(guò)蛋白序列分析, 發(fā)現(xiàn)在 Mm-CTL存在典型的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域。通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn), Mm-CTL的表達(dá)不僅受到弧菌感染的影響, 同時(shí)也受環(huán)境溫度和鹽度變化的影響。由于貝類是一種海洋無(wú)脊椎動(dòng)物, 其免疫系統(tǒng)極有可能對(duì)環(huán)境的變化做出響應(yīng)。本研究結(jié)果將為貝類先天性免疫因子表達(dá)的調(diào)控以及貝類病害的防控奠定基礎(chǔ)。

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