薛 蕊 馬海濤 韓承慧 王 斐 孫國華 姜海濱①

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306;2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006)

微衛(wèi)星標記是以 2—6個核苷酸單位組成的串聯(lián)重復序列, 存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中, 因此又稱簡單序列重復(Simple sequence repeats, SSRs)和短串聯(lián)重復(Simple tandem repeats, STRs)(Tautzet al,1984)。它由核心序列和側翼序列兩部分構成, 核心序列高度多態(tài), 而側翼序列則一般高度保守。相較于以往的分子標記, 微衛(wèi)星標記具有數(shù)量豐富、操作簡便、重復性好、共顯性遺傳等優(yōu)點(Schuget al, 1998),因此已成為水產(chǎn)動物種群遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定和遺傳圖譜構建等方面的有效工具(Chistiakovet al, 2006)。

EST(Expressed Sequence Tag)即表達序列標簽,是一段通過單向測序得到的200—250 bp核苷酸序列(侯戰(zhàn)輝等, 2008)。由于來源于cDNA文庫, 因此EST是功能基因的一部分, 可以對其進行基因注釋(邱櫻,2013)。EST-SSR即存在于EST序列上的微衛(wèi)星標記,與傳統(tǒng)的基因組微衛(wèi)星標記(Genomic-SSR)相比,EST-SSR標記開發(fā)成本低, 可以節(jié)省大量的人力物力,并且在不同物種間具有一定的通用性(易少奎等,2013; 董迎輝等, 2013), 因此已經(jīng)成為新型高效的開發(fā)SSR途徑。

許氏平 鲉(Sebastes schlegelii)又稱黑, 俗稱黑寨、黑老婆等, 是分布在西北太平洋近岸的溫水性巖礁棲息魚種, 廣泛存在于黃海、渤海近海海域, 為卵胎生魚類。由于其肉質鮮美、營養(yǎng)豐富, 而且生長較為迅速, 已成為我國北方深水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚種。進行許氏平 鲉的良種選育, 既可保護自然資源,又可提高養(yǎng)殖效率, 意義重大, 而開發(fā)具有良好多態(tài)性的微衛(wèi)星標記是進行遺傳育種的基礎。已有研究者采用 傳統(tǒng)方法開發(fā)了一些許氏平 鲉 Genomic-SSR標記(Yoshidaet al, 2005; Anet al,2009; Baiet al, 2011;Yasuikeet al, 2013), 但對EST-SSR標記的開發(fā)未見報道。本研究首次利用已發(fā)表的許氏平 鲉 EST序列進行EST-SSR標記開發(fā), 分析了與Genomic-SSR標記的差異, 并檢測了其在近緣種朝鮮平 鲉(Sebastes koreanus)、褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)的通用性,以期為許氏平鲉良種選育提供條件。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

許氏平 鲉野生群體樣品30個取自長島附近海區(qū),朝鮮平 鲉 樣品8個取自大連, 褐菖鲉樣品8個取自威海乳山。尾鰭和肌肉樣品暫存放在70%乙醇中, 帶回實驗室后于–20°C 冰箱保存。采用傳統(tǒng)酚/氯仿/異戊醇法抽提基因組 DNA, 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性、NanoDrop2000紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。DNA樣品保存于–20°C冰箱中, 實驗前進行稀釋, 終濃度為50ng/μL。

1.2 EST序列獲取及分析

從 NCBI公共數(shù)據(jù)庫(http: //www.ncbi.nlm.nil.gov/sites/entrez)下 載許氏平 鲉EST序列(檢索詞為Sebastes schlegelii)。對序列進行拼接后利用 SSR Hunter 1.3軟件查找微衛(wèi)星序列, 查找條件為: 二堿基重復5次以上(含5次); 三堿基重復4次以上(含4次); 四堿基、五堿基和六堿基重復均在 3次以上(含3 次)。

1.3 EST-SSR引物設計

用Primer Premier 5.0軟件設計引物。引物長度控制在18—22bp; GC含量控制在40%—60%, 正反引物相差不超過10%; Tm值控制在40—60°C, 正反引物相差不超 10°C; 產(chǎn)物長度控制在 100—500bp。設計好的引物送生工生物(上海)有限公司合成。

1.4 EST-SSR引物篩選與優(yōu)化

實驗在Eppendorf普通梯度PCR儀中進行。第一步用3個DNA樣品混合進行初步篩選, 選出能夠穩(wěn)定擴增目的條帶的 EST-SSR引物; 第二步對擴增效果不理想的引物進行梯度優(yōu)化。實驗用酶為TIANGEN Taq DNA Polymerase ET101-02-04, 25μL反 應 體 系 如 下: 2μL DNA 模 板(50ng/μL), 2.5μL 10×buffer, 引 物 各 1μL (50μmol/L), 0.5μL dNTP(10mmol/L), 0.2μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL), 剩余體積以滅菌水補齊。PCR程序設為: 94°C預變性5min,接著進行30個循環(huán): 94°C 變性45s, 退火45s, 72°C延伸 1min, 循環(huán)結束后 72°C延伸 10min。擴增產(chǎn)物進行8%(W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染染色,并用掃描儀拍照。

1.5 野生群體多態(tài)性檢測

篩選出的EST-SSR引物進行野生群體PCR擴增,反應體系和擴增程序同引物篩選部分, 不同引物的退火溫度參見表1。擴增產(chǎn)物進行8% (W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染染色、掃描儀拍照。

1.6 多態(tài)性微衛(wèi)星引物通用性檢測

用多態(tài)性微衛(wèi)星引物對朝鮮平 鲉 和褐菖 鲉DNA樣品進行 PCR擴增, 反應體系和擴增程序同引物篩選部分, 不同引物的退火溫度參見表 1。擴增產(chǎn)物進行8% (W/V)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染染色,掃描儀拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計各SSR位點DNA帶型, 估算條帶分子量大小, 統(tǒng)計結果輸入POPGENE 32 (Yehet al,1999)計算每個位點的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和香農(nóng)多樣性指數(shù)(I)。用軟件CERVUS 3.0(Marshallet al, 1998)計算多態(tài)信息含量(Polymorphic information content, PIC)。GENEPOP v.4.1.4(Rousset,2008)檢驗Hardy-Weinberg平衡和連鎖不平衡情況。另外統(tǒng)計18對多態(tài)EST-SSR 引物對朝鮮平 鲉和褐菖鲉個體的通用率和多態(tài)率, 分析各位點通用性情況。

2 結果與分析

2.1 許氏平鲉 EST序列中SSR位點種類、數(shù)量及出現(xiàn)頻率

從NCBI公共數(shù)據(jù)庫下載的1980條EST序列經(jīng)拼接、SSR位點查找后, 發(fā)現(xiàn) 181條 EST序列含有SSR位點, 共計 224個, EST-SSR位點的發(fā)現(xiàn)率為9.14%, 平均每條EST序列上有SSR位點1.24個。其中, 含有一個EST-SSR位點的144條, 兩個EST-SSR位點的33條, 三個及三個以上EST-SSR位點的4條。依據(jù)Weber(1990)提出的分類方法, 所有EST-SSR位點中完美型比例占到 91.52%, 二到六堿基重復均有出現(xiàn), 位點個數(shù)分別為 109、88、4、2和 2, 分別對應百分比53.17%、42.93%、1.95%、0.98%以及0.98%。其中, 二堿基重復出現(xiàn)頻率最高, 分為 10種重復類型, 以 TG/CA基序最多, 占 33.03%, 占總完美型位點的 17.56%; 三堿基重復有 23類, 以 CAG/CTG出現(xiàn)頻率最高, 為 12.50%, 四到六堿基所有重復類型皆出現(xiàn)一次。

表1 18對許氏平鲉 EST-SSR引物特征Tab.1 Characteristics of 18 pairs of EST-SSR primers for S. schlegelii

2.2 引物篩選和多態(tài)性檢測結果

對查找到的224個EST-SSR位點進行進一步分析, 挑選出部分適合設計引物的位點, 共設計引物56對, 篩選后共計 46對引物能夠進行有效擴增, 野生群體多態(tài)性檢測結果顯示, 其中 18個位點具有多態(tài)性(表1), 位點HJ4137的電泳圖見圖1。

2.3 EST-SSR位點在野生群體中的多態(tài)性評價

所有位點共檢測出70個等位基因, 每個位點觀測等位基因數(shù)為 2—9, 平均觀測等位基因數(shù)為3.89。觀測雜合度(Ho)在0.0333—0.8000之間, 平均觀測雜合度為 0.3037; 期望雜合度(He)在 0.0333—0.7927之間, 平均期望雜合度為0.3757; 香農(nóng)指數(shù)(I)在0.0848—1.7819之間, 平均香農(nóng)指數(shù)為0.7416; 每個位點的多態(tài)信息含量(PIC)在0.0323—0.7522之間,平均多態(tài)信息含量為 0.3419, 其中高度多態(tài)(PIC>0.5)位點5個, 中度多態(tài)(0.25

圖1 位點HJ4137的PCR擴增結果Fig.1 The result of PCR amplification of locus HJ4137

表2 18個許氏平鲉 EST-SSR位點的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of 18 EST-SSR loci for S. schlegelii

2.4 許氏平鲉多態(tài)性微衛(wèi)星引物的通用性檢測

在朝鮮平 鲉中除位點HJ606和HJ4183其余位點均能有效擴增, 其中6個位點多態(tài); 在褐菖 鲉中所有位點均能有效擴增, 除位點HJ4215和HJ4286單態(tài)外其余位點均為多態(tài)。18 個位點在朝鮮平 鲉 和褐菖鲉中的通用率分別是88.89%和100%, 多態(tài)率為33.33%和88.89%。其中, 位點 HJ4215和HJ4286在許氏平鲉中顯示多態(tài)而在朝鮮平 鲉 、褐菖 鲉個體中為單態(tài);位點 HJ4136、HJ4202以及 HJ4959 對許氏平 鲉、褐菖 鲉顯示多態(tài)而在朝鮮平 鲉中為單態(tài); 位點HJ606和HJ4183 對許氏平 鲉、褐菖 鲉 顯示多態(tài)而在朝鮮平鲉中不能有效擴增; 位點 HJ126、HJ4203以及 HJ4249對許氏平 鲉 、褐菖 鲉顯示多態(tài), 且對褐菖 鲉多態(tài)性更高; 位點 HJ4137、HJ4930、HJ4944以及 HJ9578在三個物種中均具有較高多態(tài)性, 且在許氏平 鲉中多態(tài)性最高(表3)。位點HJ4136 在朝鮮平 鲉 、褐菖 鲉和許氏平 鲉中的多態(tài)性檢測結果見圖2。

3 討論

到目前為止, NCBI 公共數(shù)據(jù)庫中許氏平 鲉EST序列共 1980條, 相比研究較早的水生生物來說數(shù)目較少。本研究中許氏平 鲉EST-SSR位點發(fā)現(xiàn)率為9.14%, 而海帶為 5.03%(王國良, 2010)、壇紫菜為5.64%(楊惠等, 2009)、泥蚶為 6.50%(董迎輝等, 2013)、中華鱉為 7.45%(許曉軍等, 2013)、牙鲆為 7.95%(陳松波等, 2010), 這說明相較于其它水生生物, 許氏平鲉EST-SSR位點發(fā)現(xiàn)率較高, 具有較好的開發(fā)潛力。本研究查找到的許氏平 鲉EST-SSR核心序列以二堿基重復出現(xiàn)頻率最高, 這一結果與有關馬氏珠母貝(邱櫻, 2013)、牙鲆(陳松波等, 2010)以及中華鱉(許曉軍等, 2013)的研究結果相同, 而在其它學者的研究中也存在不同結果, 比如在泥蚶、海帶和壇紫菜中均以三堿基重復最豐富(楊惠等, 2009; 王國良, 2010; 周小龍等, 2013)。

圖2 位點HJ4136 在朝鮮平 鲉 和褐菖 鲉 以及許氏平 鲉中的檢測結果Fig.2 The results of transferability of locus HJ4136 in Sebastes koreanus, Sebastiscus marmoratus and Sebastes schlegeliia: 位點HJ4136 在朝鮮平鲉 中的通用性檢測結果; b: 位點HJ4136在褐菖鲉中的通用性檢測結果; c: 位點HJ4136在許氏平鲉中多態(tài)性檢測結果

表3 18個位點通用性檢測結果Tab.3 The results of transferability of 18 loci

許氏平 鲉EST-SSR核心序列以TG/CA基序最為常見, 在 205個完美型位點中占到 17.56%, 李霞等(2004)有關劍尾魚的研究結果與之類似。18個多態(tài)EST-SSR位點中, 有4個位點核心序列是TG或CA基序, 重復次數(shù)范圍在5—14之間, 占完美型多態(tài)位點比例 26.67%, 因此在本研究中許氏平 鮋EST-SSR位點TG/CA基序的開發(fā)效率較高; 上述 4個多態(tài)位點分別是 HJ126、HJ4136、HJ4959以及 HJ4137, 對應的核心序列重復次數(shù)和等位基因個數(shù)分別為5、5、12、14和 2、4、7、9, 由此可見隨著核心序列重復次數(shù)增加位點多態(tài)性有逐漸增強的趨勢。通常認為微衛(wèi)星多態(tài)性的形成與復制過程中的滑鏈錯配有關(張云武等, 2001), 由此形成的插入或缺失突變會導致微衛(wèi)星核心序列長度的變化(喬洪金等, 2012), 而核心序列重復次數(shù)越高其出現(xiàn)插入或缺失突變的幾率就越大。

許氏平 鲉46對有效擴增的EST-SSR引物中, 其中 18對具有多態(tài)性, 多態(tài)檢測率為 39.13%; An等(2009)開 發(fā)的許氏平 鲉Genomic-SSR位點14對有效擴增, 其中 13對多態(tài), 多態(tài)檢測率高達 92.86%;Yasuike等(2013)設計30對完美型Genomic-SSR引物,其中 17對有效擴增并且顯示多態(tài), 多態(tài)檢測率為100.00%。EST序列中有效擴增的微衛(wèi)星引物中, 具有多態(tài)性的微衛(wèi)星比例明顯低于基因組中的微衛(wèi)星比例。此外, Bai等(2011)開發(fā)的多態(tài)Genomic-SSR位點平均觀測等位基因數(shù)、平均觀測雜合度以及平均期望雜合度分別為 5.7、0.4194和 0.5002, 均高于本研究開發(fā)的EST-SSR, 同樣的結果也存在于An等(2009)和Yasuike等(2013)開發(fā)的許氏平鲉Genomic-SSR標記中。上述結果均證實了以往學者有關 EST-SSR位點多態(tài)性低于 Genomic-SSR位點的結論(齊曉艷等,2013; 周小龍等, 2013)。一般認為這是由于EST序列來源于基因編碼區(qū), 更易受到選擇壓力的作用從而表現(xiàn)出較高的保守性, 因此多態(tài)性要比基因組 SSR低(Chabaneet al, 2005)。

微衛(wèi)星側翼序列在近緣物種中比較保守, 根據(jù)已有物種的微衛(wèi)星引物實現(xiàn)跨物種通用是開發(fā)微衛(wèi)星引物的一種有效途徑。分子標記可以被分為兩類,Ⅰ型分子標記與已知功能的基因相關聯(lián), 而Ⅱ型分子標記與基因組未知區(qū)域相關(O’Brien, 1991)。EST序列來源于功能基因, 由此開發(fā)的 EST-SSR引物屬于Ⅰ型微衛(wèi)星引物, 而Ⅰ型微衛(wèi)星引物已被證實比未知基因背景的Ⅱ型引物通用性更強(Holtonet al,2002)。Ma等(2010, 2011)開發(fā)了擬穴青蟹Ⅱ型和Ⅰ型微衛(wèi)星引物, 并分別檢驗其在同屬物種中的通用情況, 結果顯示紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)對擬穴青蟹(Scylla paramamosain)Ⅰ型微衛(wèi)星引物的通用性更強。本研究中開發(fā)的18對多態(tài)EST-SSR引物對褐菖 鲉的通用率和多態(tài)率分別達到100%和88.89%, 顯著優(yōu)于An等(2009)開發(fā)的14對Genomic-SSR位點,后者的相關數(shù)據(jù)分別為78.57%、78.57%。

一般認為, 對于微衛(wèi)星引物, 親緣關系越近的物種實現(xiàn)擴種擴增的可能性越大, 而在本研究中, 與許氏平鲉親緣關系較遠的褐菖鲉 (Sebastiscus marmoratus)卻表現(xiàn)出了更好的通用性。此外, 通過分析 An等(2009)有關許氏平 鲉14對微衛(wèi)星引物在4個近緣種中的通用性實驗結果得知, 與許氏平 鲉親緣關系較近的Sebastes inermis通用情況(通用率 10/14, 多態(tài)率10/14)卻沒有Sebastes marmoratus(通用率 11/14, 多態(tài)率11/14)好 。同樣的結果都與褐菖 鲉(Sebastiscus marmoratus)這個物種有關, 具體原因有待進一步研究分析。另外, 上述結果與趙麗麗(2008)在青石斑魚和美洲黑石斑魚的跨種擴增結果類似, 后者認為這可能與跨種擴增研究中使用的樣品數(shù)量有限、DNA復制時錯配而產(chǎn)生假陽性帶、副產(chǎn)物帶過多、多態(tài)位點判斷等原因有關。此外, 通用性實驗結果顯示, 位點HJ606和HJ4183 在許氏平 鲉 和褐菖 鲉中可以有效擴增而在朝鮮平 鲉中不能有效擴增, 這一結果得到進一步確認后可以應用于從上述三個物種中鑒定朝鮮平 鲉的工作。

本研究結果顯示, 許氏平 鲉EST-SSR位點檢出率較高, 具有較好的開發(fā)潛力, 實驗開發(fā)的多態(tài)EST-SSR 位點可用于許氏平 鲉群體遺傳多樣性分析、系統(tǒng)進化分析和近緣種通用性檢測等研究, 為今后許氏平 鲉的良種選育工作奠定基礎。

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