鄭利兵 吳 彪 劉志鴻① 周麗青 孫秀俊田吉騰 楊愛國 鄭言鑫

(1. 農業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071;2. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306)

凝集素(lectin)是生物體內廣泛存在的一類能使細胞發(fā)生凝集的糖類結合蛋白。作為軟體動物體液免疫的一個重要免疫因子, 凝集素在貝類免疫防御中起到異體成分的識別、調理、凝集等作用, 是構成機體防御體系的重要組成部分(翟玉梅等, 1998; Weisset al, 2000; 孫虎山等, 2001; 胥煒等, 2005)。

半乳糖凝集素(galectin)是動物凝集素家族的成員之一(Gerardoet al, 2009), 可特異性識別糖鏈末端的 β-半乳糖苷(賀雪明等, 2012), 為非膜整合性的可溶性蛋白(Barondes, 1984; Drickameret al, 1985)。在貝類等無脊椎動物發(fā)生感染時, 半乳糖凝集素通過其標志性的糖識別結構域(Carbohydrate Recognition Domain, CRD)特異性結合半乳糖苷來參與對病害的免疫反應(Dumicet al, 2006; 陳騁, 2013)。例如, 菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的半乳糖凝集素可結合派琴蟲(Perkinsus)和弧菌(Vibrio)表面的半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺而進行病原菌的識別(Kimet al,2008); 海鰻的原型galectin參與細胞對寄生蟲的包囊作用(Nakamuraet al, 2012); 大西洋鱈魚galectin-1能凝集革蘭氏陽性和陰性菌, 參與其免疫防御過程(Rajanet al, 2013)。因此, 半乳糖凝集素作為模式識別受體(Pattern Recognition Molecular, PRR)發(fā)揮作用的功能得到了廣泛研究。

Galectin 家族成員眾多, 在一種動物中可能含有不同的類型, 即使在同一種細胞中也可能會表達出幾種不同的galectin (Colnotet al, 1996)。近年來,對軟體動物半乳糖凝集素的研究中發(fā)現(xiàn)一種獨特的quadruple-galectin (Tasumiet al, 2007; Songet al, 2010;Zhanget al, 2011), 其對半乳糖凝集素家族的結構是一個新的補充。但有關該類型galectin的報道還很少, 第一個被鑒定的 quadruple-galectin是來自于美洲牡蠣(Crassostrea viginica), 它可以識別并吞噬原生動物鞭孢簇蟲(Perkinsus marinus)(Tasumiet al, 2007); 之后被鑒定的 quadruple-galectin還有 PoGal (Zhanget al,2011)、AiGal1 (Songet al, 2010)和 AiGal2 (Songet al,2011), 經過病原微生物的免疫刺激, 這些galectin的表達量都有明顯的上調。然而, 目前尚未有魁蚶(Scapharca broughtonii)半乳糖凝集素的相關報道。

魁蚶屬于雙殼綱, 蚶目, 具有適應性強、生態(tài)修復效果顯著的特點, 但近年來資源量銳減, 深入挖掘魁蚶免疫因子對其產業(yè)的發(fā)展具有重要的理論和現(xiàn)實意義。目前, 本課題組已在魁蚶血細胞分類及免疫功能研究(周麗青等, 2013, 2014)及種質資源和遺傳多樣性分析(吳彪等, 2010, 2012; 梁超等, 2011; 田吉騰, 2012; 周麗青等, 2012)等方面進行了研究, 發(fā)現(xiàn)鰻弧菌(Vibrio anguillarum)能夠啟動魁蚶的免疫防御功能。為進一步明確魁蚶半乳糖凝集素的特征和免疫作用, 本研究在魁蚶轉錄組文庫中篩選到的半乳糖凝集素序列的基礎上, 經過 RACE 擴增得到 cDNA全長序列, 并開展基因表達組織分析和鰻弧菌刺激響應規(guī)律的研究, 以期為魁蚶分子育種及抗病選育提供依據, 為認識魁蚶半乳糖凝集素和對該分子的進化、結構和功能的研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與來源

實驗用魁蚶購于青島臺東水產品市場, 殼長約55mm左右, 個體健康, 于20°C充氣海水中暫養(yǎng)一周,每天換水兩次。期間投喂硅藻, 實驗處理前兩天停止投喂。鰻弧菌為本實驗室保存的菌種。

1.2 魁蚶半乳糖凝集素基因的獲得

1.2.1 總 RNA提取 異硫氰酸胍法提取總 RNA:采用Solution D (4mol/L異硫氰酸胍, 17mmol/L月桂酰肌苷酸鈉, 25mmol/L檸檬酸鈉)與β-巰基乙醇裂解組織, 然后相同體積氯仿/異戊醇(24︰1)和水飽和酚抽提蛋白質, 異丙醇與醋酸鈉沉淀核酸, 75%乙醇洗滌核酸后干燥, 用 DNase(Progema)來去除基因組DNA, 具體步驟參照董迎輝(2012)。1.0%瓊脂糖檢測RNA 完整性, 核酸分析儀(Eppendorf)檢測其純度和濃度。

1.2.2 全長 cDNA克隆及測序 根據獲得的魁蚶半乳糖凝集素基因的部分序列, Primer Premier 5.0設計 3'RACE和 5'RACE特異性引物, 利用 SMART?RACE Amplication Kit和Advantage 2 PCR Kit用于3'端和5'端的擴增。3'RACE 擴增所用引物為SbGal-3F和通用引物UPM, 5'RACE擴增所用引物為SbGal-5R和通用引物UPM(表1)。具體步驟如下: 擴增體系為50μL, 內含 3'(5')RACE cDNA模板 2.5μL, PCR-Grade water 34.5μL, 10× Advantage2 PCR buffer 5.0μL,dNTP Mix(10mmol/L)1.0μL, UPM 5.0μL, SbGal-3F(SbGal-5R) 1.0μL; 反應程序為: 94 °C 30 s, 68 °C 30 s,72 °C 2 min, 25個循環(huán)。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、切膠回收, 回收產物分別與 PMD18-T連接, 轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞, 并挑陽性克隆進行測序。

1.2.3 序列分析 將篩選到的序列及推測的氨基酸序列與GenBank數(shù)據庫中的已知序列進行blast比對; DNAStar軟件對cDNA序列進行開放閱讀框搜索及編碼氨基酸預測; 利用 ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/)對半乳糖凝集素分子量(Mw)及等電點pI進行預測; SignalIP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找半乳糖凝集素信號肽; TargetP 1.1 (http: //www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對半乳糖凝集素進行亞細胞定位; TMHMM Server v.2.0 (http: //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白質跨膜區(qū)域; SMART (http: //www.expasy.ch/SMART)進行蛋白質結構域分析。用 NCBI的Blastp (http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對序列進行同源檢索, 取不同分類物種以及不同種類半乳糖凝集素氨基酸序列, 用DNA man8.0軟件與魁蚶鐵蛋白氨基酸序列進行同源性比對分析, 在此基礎上用 MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 半乳糖凝集素組織分布及對細菌刺激的響應模式分析

1.3.1 鰻弧菌刺激實驗 挑選健康的暫養(yǎng)魁蚶并隨機分為對照組和處理組進行鰻弧菌刺激實驗。鰻弧菌經 2216E培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后離心取沉淀, 用 PBS調整濃度至OD600=0.4 (1OD=5×108bacteria/mL)。微量注射器向處理組個體前閉殼肌處注射50μL菌懸液后放回原養(yǎng)殖槽內, 分別在0h、4h、8h、16h、24h、32h、64h隨機選取 3個個體活體取血(4°C,800r/min15min收集血細胞沉淀)、外套膜、鰓、閉殼肌、肝胰腺、斧足, 用于總 RNA的提取。對照組注射同劑量的滅菌PBS(0.1 mol/L, pH 7.4)代替鰻弧菌。

1.3.2 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR) 運用qRT-PCR檢測半乳糖凝集素轉錄本的組織分布情況及對鰻弧菌刺激的反應模式。根據獲得的半乳糖凝集素 cDNA序列, 用 Primer Premier 5.0軟件設計qRT-PCR引物 qSbGal-F、qSbGal-R(引物信息見表 1),選取β-actin基因作為內參基因(Liet al, 2012), 反應在ABI7500熒光定量PCR儀上完成。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)試劑盒進行反轉錄合成模板cDNA, 反應體積及反應條件按照說明書進行。反轉錄產物置于–20°C保存?zhèn)溆谩RT-PCR擴增體系為20μL, 包括: SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×), 10μL;PCR Forward Primer(10μmol/L), 0.8μL; PCR Reverse Primer (10μmol/L), 0.8μL; ROX Reference DyeⅡ(50×),0.4μL; cDNA 模板, 2.0μL; DEPC 水, 6.0μL。反應程序為 95°C 30 s; 95°C 5 s, 60°C 34 s, 40 個循環(huán), 95°C 15 s,60°C 1 min, 95°C 15s。實驗設置 3 個平行組。1.3.3 數(shù)據分析 軟件獲得每個反應的 CT, 采用2-DDCT方法(Livaket al, 2001)進行相對定量分析。根據每個樣品的 3個平行實驗所得的數(shù)據計算相對表達量平均值和標準差。

表1 實驗所用引物序列Tab.1 The primers used in the experiment

2 結果

2.1 SbGal基因cDNA序列分析

3'RACE和5'RACE擴增產物分別測序后與轉錄組文庫中篩選出的序列進行拼接, 獲得魁蚶半乳糖凝集素全長cDNA序列, 命名為SbGal(GenBank登錄號為KP123598)。SbGal基因cDNA全長3120bp, 包含一個213 bp的5'-端非翻譯區(qū)(5'-UTR), 1342 bp的3'-UTR和1565 bp的開放閱讀框(ORF); 其起始密碼子為ATG, 終止密碼子為TGA, Poly(A)序列上游有4個規(guī)則的加尾信號AATAAA, 很明顯, 該cDNA具有完整的蛋白質編碼區(qū)(圖1)。

氨基酸序列分析可知,SbGal基因編碼一個含有554個氨基酸殘基組成的蛋白質, 預測的分子量大小為63.3158kDa, 理論等電點為4.99。結構特征分析結果表明: 該氨基酸序列無信號肽, 也非線粒體靶向肽,無明顯的跨膜區(qū)域; 該蛋白具有多個功能化位點, 第186位NETC和319位NGTD存在潛在糖基化位點;在137、218、278、279、382處有脾酪氨酸激酶磷酸化位點, 279、382、388、526bp處有可激活胰島素受體激酶磷酸化位點, 225位有共濟失調毛細血管擴張突變激酶磷酸化位點, 374位有蛋白激酶C磷酸化位點, 218位有表皮生長因子受體磷酸化位點; 結構域的預測分析結果表明SbGal有四個糖識別結構域(CRD), 且每個結構域通過一含有 6個氨基酸的短肽鏈連接在一起, 每個CRD都含有保守的糖結合位點,第一、第三和第四 CRD均含有 132個氨基酸殘基(12—143, 286—417, 424—555), 第二CRD含有130個氨基酸殘基(150—279)。綜上分析結果表明, 本實驗成功獲得了魁蚶半乳糖凝集素基因全長cDNA。

2.2 SbGal基因同源性分析

同源性在線搜索結果顯示:SbGal編碼的氨基酸序列與其它雙殼類具有較高的相似性, 例如, 與美洲牡蠣Crassostrea viginica的相似性為70%, 合浦珠母貝Pinctada fucata為 65%, 海灣扇貝Argopectehs irradiaas為46%; 與腹足類的相似性相對較低, 與光滑雙臍螺Biompalaria glabrata兩個半乳糖凝集素氨基酸的相似性分別是30%、29%; 魁蚶半乳糖凝集素的四個 CRD彼此的相似性在 36%—41%之間, 且CDR1與CDR4的相似性最大為41%。

圖1 SbGal核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SbGal陰影部分為SbGal的四個結構域, 加粗帶下劃線的為糖結合位點, 雙下劃線分別代表起始密碼子和終止密碼子, 帶框的為加尾信號, 波浪線表示多聚尾

DNAMAN8.0軟件對SbGal基因編碼的氨基酸序列與海灣扇貝、美洲牡蠣和合浦珠母貝的氨基酸序列進行比對(圖2), 在SbGal四個CRD上都有保守的糖結合位點, 不同物種的同一種 galectin在糖結合位點上都很保守, 在SbGal的第一CRD中, 這些保守序列分別是His57, Asn59, Arg61, Asn70, Trp76, Glu79和Arg81,在其它三個CRD中這些氨基酸殘基也同樣存在。

在 GenBank上搜索選取了具有代表性物種的半乳糖凝集素序列, 利用Mega5.0構建NJ系統(tǒng)進化樹如圖3, 整個系統(tǒng)發(fā)育樹分成4大支, 原型galectin分成原型1和2兩個分支, quadruple-galectin居于這兩原型分支間, 且與原型 galectin 1首先聚在一起; 在quadruple-galectin分支中,S. broughtonii首先與C.virginica聚在一起后再與P. fucata聚類。

圖2 不同物種Galectin氨基酸序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment by DNAman 8.0框線內為半乳糖凝集素的四個糖識別結構域, 用方框標出, 糖結合位點用三角標出, 各物種GenBank登錄號為: 海灣扇貝A. irradians(ACS72240, FJ469998); 美洲牡蠣C. virginica (ABG75998); 合浦珠母貝P. fucata (ACO36044)

圖3 半乳糖凝集素的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CRDs from 21 galectins

2.3 SbGal基因組織表達差異分析

以β-actin為內參基因檢測了SbGalmRNA在健康個體不同組織中的表達差異性(圖 4), 結果表明:SbGalmRNA在斧足、鰓、外套膜、肝胰腺、閉殼肌、血細胞中都有表達, 但表達量存在明顯的差異。以肝胰腺的表達量為參考,SbGal在血細胞中的表達量最高, 為肝胰腺的87.05倍(P<0.01), 其次是在斧足當中,為72.86倍(P<0.01)。

圖4 SbGal在不同組織中的表達分布Fig.4 Distribution of SbGal gene in different tissues of S.broughtonii

2.4 SbGal在鰻弧菌感染后的表達模式

鰻弧菌感染后,SbGal在斧足、鰓、外套膜、肝胰腺、閉殼肌、血細胞 6種組織中的表達模式如圖5, 結果表明: 鰻弧菌感染后, 魁蚶 6種組織中的SbGal的表達量都明顯上調。感染4h時, 在各組織中的表達量開始明顯高于對照組, 并且在肝胰腺和閉殼肌中, 其表達量達到最大值, 分別為對照組的1430.48倍(P<0.01)、1038.23倍(P<0.01); 在斧足和鰓中的表達量于感染后 8h達到最高值, 分別為對照組的128.21倍(P<0.01)、1502.70倍(P<0.01); 在外套膜和血細胞中的表達量于感染后16h達到最高值, 分別為對照組的 361.56倍(P<0.01)、354.87倍(P<0.01)。隨后, 各組織中的表達量開始回落, 且在鰓和閉殼肌中其表達量的回落表現(xiàn)出明顯的瞬時趨勢;SbGal在肝胰腺中的表達量于感染后 32h出現(xiàn)二次表達高峰,為對照組的261.72倍(P<0.01)?？傊? 經鰻弧菌感染后,SbGal表現(xiàn)出顯著的時間依賴性, 除血細胞外還表現(xiàn)出較顯著地瞬時表達趨勢, 總體表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。

3 討論

特異性結合 β-半乳糖苷的半乳糖凝集素是動物凝集素的一種代表類型。半乳糖凝集素作為 PRR參與免疫防御, 病原微生物的刺激會調節(jié)半乳糖凝集素在生物體內的表達, 進而加強免疫應答過程(Vasta,2009)。近來, 有報道稱半乳糖凝集素結合在細胞表面和體內潛在病原微生物細胞外基質的多糖上, 在先天免疫過程中以識別效應器的角色發(fā)揮作用(Vasta,2009)。目前為止, 對無脊椎動物galectin的研究指出,quadruple-galectin僅在軟體動物中發(fā)現(xiàn), 如AiGal1、PfGal、AiGal2已被成功鑒定并做結構功能分析。本研究通過構建魁蚶高通量測序轉錄組文庫并利用RACE技術獲得了魁蚶 galectin基因全長 cDNA; 檢測了其 mRNA在魁蚶中各組織的分布情況和在外源微生物刺激下表達量的變化, 對探討半乳糖凝集素在固有免疫防御中發(fā)揮的作用具有重要意義。

現(xiàn)在已鑒定分析的 galectin無信號肽, 通過非經典的分泌方式到達細胞外(Almkvistet al, 2002)。SbGal編碼氨基酸序列的N端也不存在信號肽, 推測SbGal也是通過非經典分泌方式到達細胞外, 但還需要進一步的實驗驗證。SbGalcDNA的3'-UTR存在多個加尾信號的現(xiàn)象可能與脊椎動物galectin一樣存在多種剪切方式可產生多個轉錄變異體, 皺紋盤鮑galectin基因cDNA的3'-UTR存在3處多聚腺苷酸加尾位點(鄭明剛, 2007)。

同源性比對分析發(fā)現(xiàn)SbGal的四個結構域高度保守, 且每個結構域中與糖結合的氨基酸殘基也都高度保守, 符合半乳糖凝集素家族成員的具有保守糖識別位點(Kasaiet al, 1996; Leffler, 2001)的結構特征; NJ系統(tǒng)進化樹看到SbGal與同屬于 quadruplegalectin的其它物種的galectin聚在一起, 總之, 成功獲得的SbGal也是一種quadruple- galectin。

綜上,SbGal與已知的無脊椎動物半乳糖凝集素結構相似, 沒有信號肽且只含有典型的半乳糖凝集素識別結構域, 這一點與脊椎動物的半乳糖凝集素結構特征相一致(宋小燕, 2009)。特征性序列分析、較高的同源性、保守氨基酸殘基的存在都說明SbGal是半乳糖凝集素家族中的一個新成員, 其是在軟體動物中發(fā)現(xiàn)的又一個具有四個明顯結構域的半乳糖凝集素。因此, 本研究不僅填補了魁蚶半乳糖凝集素研究的空白, 而且還豐富了無脊椎動物半乳糖凝集素研究的相關數(shù)據。

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)SbGal與其它雙殼貝類galectin一樣在健康個體的不同組織都有表達(Tasumiet al, 2007; Songet al, 2010, 2011; Zhanget al, 2011),但表達量存在差異, 說明SbGal基因的表達不具有組織特異性, 但表達量具有一定的組織特異性。有研究表明細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染后的牡蠣oyster(Zhanget al, 2011)、文昌魚Branchiostoma lanceolatum(禹艷紅, 2007)和文蛤Meretrix meretrix(Kimet al, 2008)體內的半乳糖凝集素基因mRNA水平上調。經過鰻弧菌和藤黃微球菌(Micrococcus luteus)感染后的海灣扇貝, AiGal1 mRNA的表達量顯著上調,然而, 經酵母感染后, 其表達量基本保持不變(Songet al, 2010); 在正常情況下, 合浦珠母貝半乳糖凝集素 PoGal2持續(xù)表達, 當被溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后, 其表達量也顯著上調(Zhanget al, 2011)。本研究中鰻弧菌感染魁蚶后,SbGal在各組織的表達量都有升高, 在肝胰腺中上升幅度最大, 可能SbGal通過肝胰腺發(fā)揮對病原菌入侵的防御作用較大(鄭明剛, 2007), 或者肝胰腺是軟體動物先天免疫中合成蛋白的重要器官(Konget al, 2010; Prokhorovaet al,2010; Zhaoet al, 2010)。鰻弧菌感染后,SbGal前期的表達是逐步上調增強的, 再經過一定的時間即恢復到感染前的水平, 由此可見SbGal的表達在時間和空間上都有一定的規(guī)律, 這為進一步研究SbGal在魁蚶免疫反應中的相關免疫功能研究提供了資料。

圖5 鰻弧菌感染后魁蚶6種組織SbGal基因的表達情況Fig.5 SbGal mRNA expression level after V. anguillarum challenge in five tissuesa. 閉殼肌; b. 斧足; c. 肝胰腺; d. 鰓; e. 外套膜; f. 血細胞。與0h相比, 兩個星號表示組間差異極顯著(P<0.01), 一個星號表示組間差異顯著(P<0.05)

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