劉 玉 洪澤珊 彭逸生 徐健榮

(1. 中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 廣州 510275; 2. 廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中山大學(xué)) 廣州 510275)

紅樹植物是一類多酚(polyphenol)又稱單寧(tannin)含量較高的植物, 這一特性是紅樹植物在長(zhǎng)期的自然選擇過程中與其獨(dú)特生境協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果,是紅樹植物能夠長(zhǎng)期生存在潮間帶高鹽度、缺氧及酸性環(huán)境下的關(guān)鍵因素, 并成為紅樹植物在化學(xué)成分上的顯著特征(Chenet al, 2009; Wanget al, 2014)。

植物多酚分為水解單寧及其相關(guān)化合物和縮合單寧及其相關(guān)化合物。水解單寧(聚棓酸脂類多酚)包括棓單寧(水解后產(chǎn)生棓酸, 即沒食子酸)和鞣花單寧(水解后產(chǎn)生鞣花酸或其它與六羥基聯(lián)苯二酸有生緣關(guān)系的物質(zhì))。水解單寧在酸、堿或酶的作用下不穩(wěn)定, 容易水解?？s合單寧(聚黃烷醇類多酚), 是黃烷醇的聚合物, 主要由黃烷-3-醇(包括表/阿福豆素、表/兒茶素、表/棓兒茶素)縮合而成(石碧等, 2000)。

水解單寧的主要最小單體為沒食子酸(gallic acid,簡(jiǎn)稱 GA), 縮合單寧的主要最小單體為兒茶素(catechin, 簡(jiǎn)稱C)、表兒茶素(epicatechin, 簡(jiǎn)稱EC)、棓兒茶素(gallocatechin, 簡(jiǎn)稱 GC)和表?xiàng)攦翰杷?epigallocatechin, 簡(jiǎn)稱 EGC)。這 5種最小單體是最重要的小分子多酚代表性單體, 具有重要的生態(tài)功能, 如植物的化感作用(Liuet al, 2013)。大量研究表明多酚類物質(zhì)在不同植物群間化感作用中起到重要作用, 包括藻類、真菌、地衣、苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物(Inderjit, 1996)。研究美國(guó)東部入侵濕地環(huán)境最厲害的植物——蘆葦(Phragmites communis)對(duì)其它植被的化感作用機(jī)理, 發(fā)現(xiàn)其根泌物中最具化感活性的物質(zhì)為沒食子酸, 其對(duì)多種植被系統(tǒng)包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)具有化感毒性(Rudrappaet al, 2007)。

紅樹植物對(duì)根際環(huán)境中的微型生物群落具有重要的控制作用, 可能與其根系分泌物有關(guān)(Kimuraet al, 1989; 李玫等, 2004; 李春強(qiáng)等, 2009)。紅樹植物根系含有大量的單寧酸, 而單寧酸具有溶藻的性質(zhì)(Ayoubet al, 1985), 紅樹植物可能通過根系分泌物對(duì)底棲微藻具有抑制作用。

紅樹植物富含多酚類物質(zhì), 紅樹植物與根際微型生物群落之間存在較好的化感平衡作用。目前僅有少量研究對(duì)紅樹植物根泌物中的總酚和小分子酚酸進(jìn)行測(cè)定, 但對(duì)紅樹植物根系中具體含有多酚類物質(zhì)的種類尚缺少科學(xué)的證據(jù)。因此, 本研究選擇湛江高橋國(guó)家級(jí)紅樹林自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行原位采樣, 對(duì)5種紅樹植物根系進(jìn)行 5種小分子多酚單體(micro molecule polyphenol monomers)(后簡(jiǎn)稱為多酚單體)的定性及定量測(cè)定, 科學(xué)回答自然環(huán)境下紅樹植物根系多酚類物質(zhì)的組成和含量特點(diǎn), 對(duì)全面理解紅樹植物的生態(tài)作用具有重要的理論研究意義, 同時(shí)也可為紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的科學(xué)管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域及采樣定位

采樣在湛江紅樹林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)研究基地進(jìn)行, 該保護(hù)區(qū)是我國(guó)現(xiàn)存紅樹林連片面積最大的一個(gè)自然保護(hù)區(qū), 高橋紅樹林保護(hù)區(qū)是其主要核心區(qū)域之一。對(duì)5種重要的建群紅樹植物群落在退潮時(shí)進(jìn)行采樣, 為木欖(Bruguiera gymnorrhiza,Bg)、秋茄(Kandelia candel,Kc)、桐花樹(Aegiceras corniculatum,Ac)、無瓣海桑(Sonneratia apetala,Sa)群落及紅海欖(Rhizophora stylosa,Rs)群落, 并對(duì)低潮帶桐花樹(簡(jiǎn)稱Ac-L)也進(jìn)行采樣。每種紅樹植物群落內(nèi)設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn), 即選擇樹高相近之3株植物, 每株紅樹植物均用經(jīng)緯度儀準(zhǔn)確定位, 由于采樣面積較大, 范圍大致在 21°32′35.06″N, 109°46′09.01″E 間。

1.2 采樣時(shí)間與方法

采樣于2013年9月上旬進(jìn)行。根系樣品采集: 根據(jù)不同紅樹植物根系特征采集紅樹植物支柱根頂部,將紅樹植物支柱根周圍的土刨開, 然后小心地將根系挖出, 抖落或輕輕刮下根系表面土, 混合根系樣品并裝入密封袋內(nèi)冷凍保存。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)洗凈后選取紅樹植物根尖10 cm以內(nèi)的根段。真空冷凍干燥。

1.3 多酚類物質(zhì)小分子單體測(cè)定方法

由于目前尚未發(fā)現(xiàn)有同時(shí)測(cè)定這 5種小分子多酚的文獻(xiàn)報(bào)道, 本研究對(duì)多篇文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行整合并改良(Bieriet al, 1979; Wanget al, 2003; Soonget al, 2006; Matilainenet al, 2011), 采用提取-純化-高效液相色譜(HPLC)測(cè)定步驟, 同時(shí)測(cè)定根系中其含量,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 5種小分子多酚色譜峰分離效果較好, 加標(biāo)回收率均在60%以上。

(1) 提取和純化: 稱取0.2 g 100目根系凍干樣品于10 mL聚四氟乙烯離心管內(nèi), 加入3 mL 80%甲醇,45°C下水浴超聲30 min(超聲頻率為100 Hz), 8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min, 轉(zhuǎn)移上清液于試管中, 重復(fù)提取3次, 合并提取液后過濾至雞心瓶?jī)?nèi), 取3 mL 80%甲醇溶液潤(rùn)洗試管并過濾至雞心瓶。加10 mL高純水于雞心瓶中, 和提取液搖勻后旋蒸去除提取液中的甲醇, 將剩下的水提取液加等量乙酸乙酯進(jìn)行萃取, 重復(fù)3次, 合并3次萃取獲得的乙酸乙酯相, 旋蒸至干,密封冷藏保存。上機(jī)前加入1 mL 20%甲醇溶液溶解,過0.45 μm濾膜。

(2) HPLC儀測(cè)定: 色譜條件: C18柱; 流動(dòng)相A:0.1%(V/V)磷酸-水溶液; 流動(dòng)相 B: 甲醇-0.1%(V/V)磷酸溶液。梯度洗脫: 0—15 min, 21% 流動(dòng)相B; 15—20 min, 21%至50% 流動(dòng)相B; 檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm; 進(jìn)樣量: 10 μL; 流速: 1.0 mL/min; 柱溫: 30°C。所用試劑均為高效液相色譜純級(jí)別。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理方法

綜合使用 Excel(2003和 2007)、SPSS(17.0)、OriginPro(8)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值等的分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 五種紅樹植物根系 5種小分子多酚定性和定量分析

按照前述提取方法和色譜條件, 對(duì)5種紅樹植物根系17個(gè)根樣凍干樣品中的5種小分子多酚單體進(jìn)行了定性定量分析。5種小分子多酚能夠較好地分離以及定性定量, 表1和圖1分別為5種小分子多酚的保留時(shí)間及標(biāo)樣的高效液相色譜圖。

表1 標(biāo)樣中5種多酚單體的保留時(shí)間(min)Tab.1 Retention time (min) of 5 polyphenol monomers in standard sample

圖1 五種多酚單體標(biāo)樣的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 5 polyphenol monomers in standard sample

紅樹植物根系中 5種小分子多酚單體的高效液相色譜圖(17張譜圖中僅挑選桐花樹-L1一張展示)見圖2, 根據(jù)色譜圖中各色譜峰出峰時(shí)間對(duì)5種小分子多酚進(jìn)行定性分析, 5種紅樹植物根系基本上全部含有這5種小分子多酚單體(17個(gè)樣品中應(yīng)有85個(gè)峰,實(shí)際出現(xiàn)77個(gè)峰, 8個(gè)峰為0值)。

圖2 五種紅樹植物根系提取液中五種多酚單體的液相色譜圖(以桐花樹-L1為例)Fig.2 Chromatograms of 5 polyphenol monomers in root extracts of five mangrove plants (taking Aegiceras corniculatum-L1 as example)

再根據(jù)峰面積計(jì)算其含量, 進(jìn)行分析, 如圖 3—圖7。

圖3 五種多酚單體在五種紅樹植物根系提取液中單株中最大值比較Fig. 3 Highest contents of 5 polyphenol monomers in root extracts in a single mangrove plant

圖4 每種多酚單體含量平均值在五種紅樹植物根系提取液中的比較Fig.4 Average content of each polyphenol monomer in root extracts of five mangrove plants

圖5 五種多酚單體平均值在五種紅樹植物根系提取液中的比較Fig.5 The average contents of 5 polyphenol monomers in root extracts of five mangrove plants

對(duì)5種紅樹植物單株根系提取液中5種小分子多酚最高值進(jìn)行比較, 從圖3可以看出, 17個(gè)樣品中兒茶素(C)單株含量最高值出現(xiàn)在低潮帶桐花樹樣品(Ac-L3)中, 為1.7424 mg/gDW。棓兒茶素(GC)單株含量次高出現(xiàn)在秋茄樣品(Kc3)中, 為1.1470 mg/gDW。表 棓兒茶素(EGC)單株含量第 3出現(xiàn)在紅海欖樣品(Rs3)中, 為0.4457 mg/gDW。沒食子酸(GA)單株含量第4出現(xiàn)在木欖樣品(Bg2)中, 為0.2374 mg/gDW。表兒茶素(EC)單株含量排最后, 出現(xiàn)在秋茄(Kc3)樣品中, 為0.3331 mg/gDW。

對(duì)5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的3株樣品平均值進(jìn)行比較, 見圖4。從圖4可以看出, 以秋茄樣品 棓兒茶素(GC)的平均含量最高, 3個(gè)樣品的平均值最高達(dá)1.0914 mg/gDW。低潮帶桐花樹樣品中, 以兒茶素(C)含量最高, 平均值最高達(dá)0.9650 mg/gDW。秋茄也含有最高的表兒茶素(EC)含量, 平均值最高值為0.2196 mg/gDW。紅海欖含有最 高的表 棓兒茶素(EGC)含量, 平均值最高值為0.1500 mg/gDW。木欖含有最高的沒食子酸(GA)含量,平均值最高值為0.1289 mg/gDW。

對(duì)5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的平均值進(jìn)行比較, 見圖5。從圖5可以看出, 以秋茄(Kc)和低潮帶桐花樹(Ac-L)樣品5種小分子多酚含量平均值最高, 分別為0.2778 mg/gDW、0.2379 mg/gDW。木欖(Bg)、無瓣海桑(Sa)相差不大, 依次為 0.0766 mg/gDW、0.0734 mg/gDW。紅海欖(Rs)、桐花樹(Ac)最低, 平均值分別為0.0488 mg/gDW、0.0341 mg/gDW。

對(duì)5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的總平均值進(jìn)行比較, 見圖6。從圖6可以看出, 以棓兒茶素(GC)的含量最高, 平均值最高達(dá) 0.2259 mg/gDW,兒茶素(C)含量次高, 平均值最高為0.2234 mg/gDW。表兒茶素(EC)含量第3, 平均值為0.0651 mg/gDW。沒食子酸(GA)含量第4, 平均值為0.0638 mg/gDW。表?xiàng)?兒茶素(EGC)含量最低, 平均值為0.0457 mg/gDW。

圖6 五種多酚單體總平均值含量比較Fig.6 Comparison of the total average contents of 5 polyphenol monomers

圖7 五種紅樹植物根系中五種多酚單體含量總圖Fig.7 Contents of 5 polyphenol monomers in root extracts of five mangrove roots

對(duì)5種紅樹植物根系提取液中5種小分子多酚含量的總體狀況進(jìn)行比較, 見圖7。從圖7可以看出, 以秋茄(Kc)三株植物的5種小分子多酚含量最高, 其中以 棓兒茶素(GC)為主。低潮帶桐花樹(Ac-L)樣品有 2株分子多酚含量最高, 其中以沒食子酸(GA)為主。無瓣海桑(Sa)三株含量相差不大, 以沒食子酸(GA)和兒茶素(C)相對(duì)含量較高。桐花樹(Ac)、紅海欖(Rs)、木欖(Bg)單株含量相差較大, 其中有1株相對(duì)含量較高。

2.2 紅樹植物根系小分子多酚組成特點(diǎn)及生態(tài)功能

許多研究顯示植物分泌的次生代謝物質(zhì)對(duì)水體中的微藻能產(chǎn)生化感抑制作用(Muratovaet al, 2009;Zhuet al, 2010), 且分析檢測(cè)結(jié)果多發(fā)現(xiàn), 有效抑藻成分大多屬于多酚類物質(zhì)。穗花狐尾草(Myriophyllum spicatum)提取物對(duì)銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)存在抑制作用, 在其提取物中檢測(cè)出多種多酚類物質(zhì),包括沒食子酸、連苯三酚、兒茶素、鞣花酸、阿魏酸等(Planas, 1981; Nakaiet al, 2000)。14種多酚中有10種具有抑藻作用, 且兒茶素和對(duì)苯三酚的抑藻效應(yīng)最強(qiáng)(Nakaiet al, 2001)。蘆葦?shù)母癄€提取液中含有8種多酚類物質(zhì), 其中芥子酸、丁香酸、咖啡酸和沒食子酸等4種多酚具有很強(qiáng)的抑藻性(Nakaiet al, 2006)。近年研究結(jié)果顯示, 焦棓酚(pyrogallol)或焦棓酸(pyrogallic acid)對(duì)M. aeruginosa和Cylindrospermopsis raciborskii的生長(zhǎng)、氧化壓力及基因表達(dá)都起到作用(Shaoet al,2009; Wuet al, 2013)。

對(duì) 14種植物多酚的抑藻效果進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)其抑藻效能與其酚羥基的數(shù)量及酚羥基的取代位置相關(guān), 擁有 2—3個(gè)酚羥基的植物多酚抑藻效果最顯著(Nakaiet al, 2001; Sunet al, 2010)。沒食子酸和(+)-兒茶素對(duì)赤潮藻塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的化感作用比香草醛強(qiáng), 可能是因?yàn)闆]食子酸和(+)-兒茶素的苯環(huán)上都存在3―5個(gè)羥基, 而香草醛僅存在1個(gè)羥基(楊維東等, 2005)。

有研究顯示某些低分子量的多酚對(duì)某些微生物具有較強(qiáng)的抑制能力, 包括沒食子酸和兒茶素,甚至比單寧酸和茶單寧的抑制能力還強(qiáng), 原因可能是某些具有毒性的低分子多酚易于透過微生物膜直接對(duì)其細(xì)胞的代謝作用產(chǎn)生影響, 使得低分子量的多酚毒性可能比單寧還強(qiáng)(石碧等, 2000; Xieet al, 2013)。

本研究證實(shí)紅樹植物根系中普遍含有 5種重要的小分子多酚單體, 有些還具有相當(dāng)高的單株含量,如兒茶素(C)最高可達(dá)1.7424 mg/gDW, 棓兒茶素(GC)最高為 1.1470 mg/gDW, 表?xiàng)攦翰杷?EGC)0.4457 mg/gDW, 沒食子酸(GA)0.2374 mg/gDW, 表兒茶素(EC)0.3331 mg/gDW。這些低分子量的具有多個(gè)羥基的小分子多酚是否會(huì)以根系分泌物的形式進(jìn)入到根際環(huán)境從而對(duì)紅樹植物根系微型生物群落起到重要調(diào)控作用, 以及其調(diào)控機(jī)理和相關(guān)效應(yīng)大小, 有待進(jìn)一步深入分析。

3 結(jié)論

湛江紅樹林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū) 5種重要的建群紅樹植物根系基本上全部含有5種小分子多酚單體, 濃度含量范圍在0.0007—1.7424 mg/gDW。單株含量最高值分別為, 低潮帶桐花樹兒茶素為1.7424 mg/gDW, 秋茄棓兒茶素為 1.1470 mg/gDW, 紅海欖表 棓兒茶素0.4457 mg/gDW, 木欖沒食子酸 0.2374 mg/gDW, 秋茄表兒茶素0.3331 mg/gDW。5種小分子多酚含量的總平均值以秋茄和低潮帶桐花樹最高, 分別為0.2778 mg/gDW、0.2379 mg/gDW。木欖和無瓣海桑次之, 依次為0.0766 mg/gDW、0.0734 mg/gDW。紅海欖和桐花樹相對(duì)最低, 分別為 0.0488 mg/gDW、0.0341 mg/gDW。五種紅樹根系內(nèi)均檢測(cè)出5種小分子多酚單體, 對(duì)全面理解和闡述紅樹植物的化感作用和生態(tài)功能具有重要意義。

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