鄭欣 ，李東亞，陳一心，邱旭升，朱彥丞，施鴻飛 ，王駿飛，熊進

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210008；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨科，江蘇 徐州 221000)

·論 著·

SF/PLCL紡絲材料復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨骨缺損的實驗研究

鄭欣1，李東亞2，陳一心1，邱旭升1，朱彥丞1，施鴻飛1，王駿飛1，熊進1

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210008；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨科，江蘇 徐州 221000)

目的:研究SF/PLCL紡絲材料復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨骨缺損的能力。方法:取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)并制成BMSCs/藻酸鈣水凝膠。選擇8只6月齡雄性新西蘭兔，于雙側(cè)橈骨中段制備15 mm大段骨缺損模型。其中實驗組雙側(cè)植入SF/PLCL后注入BMSCs/藻酸鈣水凝膠；對照組單純行雙側(cè)橈骨缺損手術(shù)。所有兔于術(shù)后12周行CT檢查觀察骨缺損修復(fù)情況，之后處死兔，大體及組織學(xué)觀察骨修復(fù)情況。結(jié)果：術(shù)后12周CT及組織學(xué)檢查顯示:實驗組紡絲材料塌陷，材料部分降解，纖維細(xì)胞長入材料內(nèi)部；骨缺損斷端有骨組織沿套管材料生長，但骨缺損未完成橋接。對照組缺損區(qū)域軟組織填充，骨缺損斷端封閉。結(jié)論：SF/PLCL套管材料雖具有良好的生物相容性，但尚不足以用于修復(fù)兔橈骨骨缺損，其成骨能力及降解能力有待進一步提升。

絲素蛋白；聚左旋乳酸—己內(nèi)酯；橈骨；骨缺損；兔

骨組織工程技術(shù)是將種子細(xì)胞種植于支架材料后植入骨缺損部位，隨支架材料降解，種子細(xì)胞增殖分化為成骨細(xì)胞，進而完成骨缺損的修復(fù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于修復(fù)大段骨缺損的基礎(chǔ)研究[1-3]。絲素蛋白(silk protein， SF)屬天然衍生物材料，聚左旋乳酸—己內(nèi)酯(polyL-lactide-co-caprolactone，PLCL)為人工合成高分子材料，兩者在體內(nèi)均可完全降解且無毒副作用，是常用的骨組織工程支架材料。本課題組前期研究中，成功建立了6月齡雄性新西蘭兔橈骨骨缺損動物模型[4]。本研究中將SF/PLCL復(fù)合兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells， BMSCs)構(gòu)建組織工程骨，用于修復(fù)新西蘭兔橈骨缺損，探討其成骨能力，以期為骨組織工程研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1主要試劑及儀器 主要試劑為海藻酸鈉干粉(上海賀寶化工公司)、PBS培養(yǎng)液、氯胺酮、3%戊巴比妥鈉、青霉素。主要器械及儀器為:骨髓穿刺包、骨科常用手術(shù)器械、X線攝片機(OPTIMUS 500MA，荷蘭PHILIPS公司)、CT(Lightspeed 16層螺旋CT，美國GE公司)。

1.1.2實驗材料及實驗動物 SF/PLCL套管材料(內(nèi)徑為4 mm)，與兔橈骨中段直徑相適應(yīng)，經(jīng)60Co消毒備用(該材料由東華大學(xué)材料學(xué)院制備提供)。選取6月齡雄性新西蘭兔[由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物中心提供，動物質(zhì)量許可證號:SCXK(蘇)2006-0009]，體重3.0～3.5 kg，妊娠分娩正常，無明顯生長發(fā)育異常、腫瘤等疾病。

1.2 實驗方法

1.2.1兔BMSCs的分離、培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo) 3只實驗兔以3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉成功后，無菌操作下，于股骨頭行骨髓穿刺術(shù)抽取骨髓約5 ml，置于離心管中保存。將采集到的抗凝骨髓用密度梯度離心法分離骨髓中的單個核細(xì)胞。運用差速貼壁法純化細(xì)胞，4～5 d傳代1次。收集4～6代MSCs，并調(diào)整濃度為2×106個·ml-1。將海藻酸鈉干粉(Sigma Aldrich)溶于超純水中，濃度為1.5%，磁力攪拌2 h后以0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。? ml細(xì)胞PBS懸液(約2×106MSC細(xì)胞)緩慢加入4 ml藻酸鈉溶液中，制成含細(xì)胞混懸液。以濕熱滅菌的1.132%CaCl2凝膠化，制成BMSCs/藻酸鈣水凝膠，分裝于注射器內(nèi)備用。

1.2.2兔橈骨缺損模型的建立及SF/PLCL套管置入 選取6月齡雄性新西蘭大白兔8只，隨機分為實驗組及對照組，各4只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后采用3%戊巴比妥鈉20 mg·kg-1麻醉，將雙側(cè)前臂備皮后仰臥位固定于兔板，消毒鋪單，于前臂橈側(cè)中上段切開皮膚、皮下組織及筋膜，分離肌肉至橈骨骨膜；以橈骨弧頂為中點，去除橈骨骨膜，用裝載直徑10 mm砂輪磨片的骨科電鉆將橈骨截除，并仔細(xì)分離缺損區(qū)域內(nèi)殘留骨膜，分別制作缺損長度為15 mm的骨缺損。術(shù)中使橈骨骨缺損兩斷面均垂直于尺骨縱軸，截除橈骨后用 20 ml 生理鹽水將缺損處骨碎屑、骨髓組織等徹底沖洗干凈。實驗組雙側(cè)缺損處植入SF/PLCL套管材料后注入BMSCs/藻酸鈣水凝膠，對照組僅制造雙側(cè)橈骨15 mm骨缺損，不植入任何材料(圖1)。依次縫合肌膜及皮下組織、皮膚，碘伏消毒切口并仔細(xì)包扎，單籠飼養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素 80 萬單位，切口每天予碘伏消毒換藥直至2周拆線。

1.2.3觀察指標(biāo) 記錄兔的進食、活動等一般情況，切口有無紅腫、滲出等表現(xiàn)。于術(shù)后12周攝X線片，并進行CT掃描三維重建，觀察骨缺損修復(fù)情況；影像學(xué)檢查完成后處死實驗兔，大體觀察后留取標(biāo)本行HE染色，組織學(xué)觀察骨修復(fù)情況。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后一般情況

切口無紅腫、滲液等炎癥反應(yīng)，均一期愈合，實驗兔進食和日?；顒诱?。術(shù)后4周時，實驗組1只實驗兔左側(cè)尺骨骨折，在進行組織學(xué)及影像學(xué)分析時該只兔骨折側(cè)不予計入結(jié)果分析。

A.SF/PLCL套管材料；b.實驗組SF/PLCL套管材料植入兔橈骨大段骨缺損；c.對照組橈骨中段15 mm缺損的大段骨缺損

圖1 SF/PLCL套管材料及植入兔體內(nèi)術(shù)中照片

2.2 大體觀察

術(shù)后12周，處死實驗兔可見:實驗組7側(cè)橈骨缺損處均見SF/PLCL套管材料塌陷，骨缺損斷端有骨組織沿套管材料生長，但骨缺損未完成橋接；對照組7側(cè)缺損區(qū)域軟組織填充，骨缺損斷端封閉(圖2)，1側(cè)缺損區(qū)域尺骨側(cè)見少量凹凸不平的新骨生成。

2.3 影像學(xué)結(jié)果

CT掃描三維重建圖像顯示:實驗組7側(cè)橈骨中有6側(cè)骨缺損斷端見骨組織沿套管走行生長，但骨缺損僅少量連接，1側(cè)缺損區(qū)域未見明顯新骨生成。對照組見骨缺損斷端封閉，8側(cè)均未見缺損修復(fù)(圖3)。

2.4 組織學(xué)結(jié)果

實驗組SF/PLCL套管材料塌陷，套管內(nèi)側(cè)壁有骨細(xì)胞黏附，纖維細(xì)胞長入材料內(nèi)部，缺損未修復(fù)；對照組缺損區(qū)域軟組織填充，骨缺損斷端封閉(圖4)。

3 討 論

組織工程研究中，支架材料需具有仿天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性等特點。靜電紡絲技術(shù)可制作出相互連接的多孔網(wǎng)絡(luò)狀仿生非編織支架[5]，而且可通過調(diào)整溶液酸堿度、電場強度、溫度和濕度，調(diào)控纖維直徑和取向等參數(shù)[6]。應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)將可生物降解的聚合物制作而成的納米纖維支架，能夠促進細(xì)胞黏附、伸展、增殖、遷移，提高組織再生能力，可用于各種組織修復(fù)與再生[7-9]。

靜電紡絲組織工程支架材料SF具有良好的生物相容性、氧氣和水蒸氣滲透性及生物降解性，且較膠原蛋白引起的炎癥反應(yīng)更小，同時SF提取純化方式簡單，成本低廉，但其機械性能較差，不足以維持支架外形[10-12]。而PLCL是左旋乳酸和己內(nèi)酯的共聚物，其降解率和機械性可通過乳酸和己內(nèi)酯的比例進行調(diào)整[13]。何曉敏等[14]在利用膠原/PLCL復(fù)合納米纖維電紡膜構(gòu)建組織工程化氣管補片的研究中，分離培養(yǎng)兔肋軟骨細(xì)胞，并構(gòu)建細(xì)胞材料復(fù)合物，體外培養(yǎng)4周后植入裸鼠背部皮下，4周后取出進行組織學(xué)染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)檢測，實驗結(jié)果表明，膠原/PLCL復(fù)合納米纖維電紡膜對兔肋軟骨細(xì)胞有良好的生物相容性，復(fù)合肋軟骨細(xì)胞的組織工程化軟骨，適合構(gòu)建組織工程化氣管補片。PLCL最大的缺陷是缺乏自然的細(xì)胞識別點[15]，SF/PLCL靜電紡絲復(fù)合多孔管狀材料可結(jié)合二者的優(yōu)點，既具有良好的細(xì)胞黏附性，又具備一定的機械強度。李綱等[16]在關(guān)于SF/PLCL納米纖維支架構(gòu)建組織工程化角膜上皮的研究中，靜電紡絲溶液中SF和PLCL的質(zhì)量比為25∶75 ，構(gòu)建的納米纖維薄膜平均纖維直徑為(715±186) nm，植于材料上復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞生長良好，均勻分布，他們認(rèn)為，角膜上皮細(xì)胞與SF/PLCL納米纖維膜的生物相容性良好。SF/PLCL靜電紡絲復(fù)合材料具有良好的生物相容性、可控的機械性及降解率，但應(yīng)用于修復(fù)大段骨缺損的研究尚少，因此，我們試將SF/PLCL復(fù)合兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨，用于修復(fù)新西蘭兔橈骨骨缺損，觀察其修復(fù)骨缺損的能力。

A.對照組術(shù)后12周，橈骨中段15 mm缺損，缺損斷端封閉，未見骨缺損愈合；b、c.實驗組術(shù)后12周，見新生成骨組織沿SF/PLCL套管材料側(cè)面生長，SF/PLCL套管材料塌陷，材料部分降解，骨缺損未完全愈合

圖2 術(shù)后12周兩組橈骨標(biāo)本外觀照片

A.對照組術(shù)后12周，橈骨中段15 mm缺損大段骨缺損，缺損斷端封閉，未見骨缺損愈合；b.實驗組術(shù)后12周，見缺損斷端有新骨生成，但不足以修復(fù)骨缺損

圖3 兩組術(shù)后12周橈骨CT三維重建

A.實驗組術(shù)后12周，SF/PLCL套管材料(M)部分降解，套管內(nèi)徑見新骨生長(箭頭所示) HE×10；b.實驗組術(shù)后12周，缺損處見SF/PLCL套管材料部分降解，并發(fā)現(xiàn)纖維細(xì)胞(箭頭所示)長入套管材料 HE×40；c.對照組術(shù)后12周，橈骨中段15 mm 缺損大段骨缺損，缺損斷端封閉，缺損區(qū)域見纖維組織填充(箭頭所示)，未見骨缺損愈合 HE×10

圖4 組織學(xué)圖片

在修復(fù)骨缺損的研究中，建立科學(xué)合理的骨缺損動物模型具有重要意義[1,17]。課題組在前期研究中，采用6月齡雄性新西蘭兔，對兔橈骨大段骨缺損動物模型進行了探討[4]。而既往研究中關(guān)于術(shù)后觀察骨缺損修復(fù)的時間點各不相同。Bodde等[18]認(rèn)為，術(shù)后8周到12周的時間段是骨缺損完成修復(fù)的一個過渡階段。為了較完整地觀察骨缺損修復(fù)過程，我們選擇12周作為骨修復(fù)的術(shù)后觀察時間。術(shù)后12周，對照組實驗兔橈骨缺損均未愈合，證實了本研究成功構(gòu)建了兔橈骨大段骨缺損動物模型；而實驗組在組織學(xué)切片中可觀察到，SF/PLCL支架材料已部分降解，支架材料內(nèi)已長入纖維細(xì)胞，表明該材料具有良好的生物相容性，但與對照組相比較，該復(fù)合材料的成骨能力尚須改善，材料構(gòu)成及復(fù)合種子細(xì)胞的方式需進一步優(yōu)化。

綜上所述，雖然靜電紡絲SF/PLCL管狀材料具有良好的生物相容性，然而實驗結(jié)果中觀察到其尚不足以修復(fù)兔橈骨大段骨缺損，其成骨能力及降解能力有待進一步研究及改良。

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Repair of radius detection by SF/PLCL spinning composited with BMSCs in rabbits

ZHENG Xin1，LI Dong-ya2，CHEN Yi-xin1，QIU Xu-sheng1，ZHU Yan-cheng1，SHI Hong-fei1，WANG Jun-fei1，XIONG Jin1

(1.DepartmentofOrthopaedics，theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool，Nanjing210008，China; 2.DepartmentofOrthopaedics，theAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000，China)

Objective: To study the osteogenic potential of SF/PLCL electrospinning material composited with bone mesenchymal stem cells (BMSCs) in repairing the radius defection in rabbits. Methods: BMSCs were obained from rabbits and then mixed for BMSCs/Alginate hydrogel. Eight 6-month-old male New Zealand white rabbits were recruited and 15 mm defect was created in both sides of the radius. In the experimental group， SF/PLCL spinning composited with BMSCs/alginate hydrogel was implanted into the bone defect. In the control group， only bilateral surgery of radial defect was performed. Twelve weeks postoperatively， CT scan reconstruction were used to evaluate the bone formation. Then the rabbits were sacrificed and the specimens were harvested for histologic study. The specimens were embedded in paraffin， followed by decalcification and then stained by hematoxylin and eosin (HE) for histomorphometric analysis to evaluate the bone repair. Results:Twelve weeks postoperatively， CT scan reconstruction and HE staining showed that SF/PLCL spinning degraded partly in the experimental group， and the bone formed along the casing stump， but the bone defect was not fully bridged; While in the control group， the defect was filled with soft tissue， and the ends of bone defects were closed. Conclusion: SF/PLCL casing material in this study shows good biocompatibility， but its osteogenic ability and degradation need to be further refined.

silk protein; polyL-lactide-co-caprolactone; radius; bone defect; rabbits

2015-01-29

2015-02-13

國家自然科學(xué)基金項目(81401793);江蘇省社會發(fā)展基金項目(BE2011604);江蘇省六大人才高峰項目(2012-WS-092);南京市衛(wèi)生局項目(YKK13079、ZKX12016)資助

鄭欣(1985-)，男，江蘇東臺人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。E-mail:thindy1980@163.com

陳一心 E-mail:chenyixin93@126.com

鄭欣，李東亞，陳一心，等.SF/PLCL紡絲材料復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨骨缺損的實驗研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：376-380.

R683

A

1671-6264(2015)03-0376-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.010