韓瑩倩，孔江南，王 江，張 超，楊國宇

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，鄭州 450002)

霍亂弧菌DncV蛋白的原核表達及活性分析

韓瑩倩，孔江南，王 江，張 超，楊國宇*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動物生化與營養(yǎng)重點開放實驗室，鄭州 450002)

DncV(VC0179)是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的一種雙核苷酸環(huán)化酶，其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP。研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP作為胞內(nèi)的第二信使，通過STING信號通路激活先天性免疫應(yīng)答。為了體外制備c-di-GMP用于深入研究其功能，構(gòu)建了VC0179融合cherry標簽的丙酸誘導(dǎo)型表達載體，并將該重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中。利用丙酸鈉誘導(dǎo)表達后，觀察菌體顏色是否為紅色判斷融合蛋白質(zhì)的表達。超聲破碎細菌后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白質(zhì)的可溶性表達。最后通過Ni-NTA Agarose親和純化重組蛋白質(zhì)，獲得的重組蛋白質(zhì)進行體外酶促反應(yīng)，高效液相色譜檢測合成產(chǎn)物c-di-GMP。結(jié)果表明：成功構(gòu)建VC0179丙酸誘導(dǎo)型原核表達載體并獲得了高純度的VC0179重組蛋白質(zhì)。該重組蛋白質(zhì)通過體外酶促反應(yīng)可一步生成c-di-GMP。本試驗建立了穩(wěn)定獲得具有酶活性的VC0179重組蛋白質(zhì)的方法；c-di-GMP的體外合成為其后續(xù)功能研究及大量制備奠定基礎(chǔ)。

VC0179；c-di-GMP；原核表達；酶促合成法；高效液相色譜

DncV(VC0179)是在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的一種催化合成c-di-AMP、c-di-GMP、c-GAMP雙核苷酸環(huán)化酶[1]。其合成產(chǎn)物c-di-AMP與c-di-GMP作為胞內(nèi)的第二信使可調(diào)節(jié)細菌體內(nèi)的多種應(yīng)答[2]。19世紀90年代，人們首次發(fā)現(xiàn)c-di-GMP對醋酸纖維桿菌的生物膜形成具有重要的調(diào)節(jié)作用，是一種新型纖維素合成酶變構(gòu)調(diào)節(jié)因子[3-4]。此外，c-di-GMP在細胞周期、生長發(fā)育、菌毛生成、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、RNA調(diào)節(jié)、壓力應(yīng)激、細菌捕食、毒力等多方面發(fā)揮調(diào)控作用[2，5-6]。在哺乳動物細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，c-di-GMP、c-GAMP作為胞內(nèi)的第二信使，可直接與STING相互作用激活干擾素效應(yīng)模式識別系統(tǒng)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達[7-9]。鑒于VC0179合成產(chǎn)物在生物體中的重要功能，本試驗構(gòu)建了VC0179丙酸誘導(dǎo)型原核表達載體，并對其進行表達分析與純化，獲得高純度的VC0179靶蛋白。體外一步法合成c-di-GMP為進一步功能研究及免疫增強劑c-di-GMP產(chǎn)品的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、膠回收試劑盒及PCR純化試劑盒均購自生工生物工程(上海)有限公司；Ni-NTA Agarose購自Qiagen公司；T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自英國NEB公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；GTP標準品購于Aladdin公司；c-di-GMP標準品購于Invivogen公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙酸銨和MgCl2購于Sigma公司；色譜甲醇購于Fisher公司；E.coilDH5α、E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細胞和TEV酶均為本室保存；含全長VC0179重組質(zhì)粒pMD19-VC0179及含His和cherry標簽的丙酸誘導(dǎo)型載體由本室構(gòu)建保存。

1.2 表達載體的構(gòu)建及鑒定

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD19-VC0179，獲得VC0179目的片段的全長。用T4連接酶將其與同樣酶切處理的丙酸誘導(dǎo)型載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coilDH5α。轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素(100 mg·mL-1) LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選陽性克隆，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗證后，送往生工生物工程(上海)有限公司測序鑒定。

1.3 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達及可溶性鑒定

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)。在含Amp的LB平板上挑取含重組質(zhì)粒的單個菌落，接種于含100 mg·mL-1Amp的2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。將得到的菌液按體積比1∶100接種于含100 mg·mL-1Amp的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600 nm達0.6，將菌液分兩等份，一瓶加入20 mmol·L-1的丙酸鈉，室溫過夜誘導(dǎo)表達，另外一瓶作為空白對照不加誘導(dǎo)劑室溫過夜搖菌。次日各吸取1 mL，離心去上清，加PBS重懸，加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水煮10 min。剩余的菌液離心收集沉淀，10 mL PBS重懸菌體，加溶菌酶(1 mol·L-1)冰浴30 min后，低溫超聲波破碎菌體(超聲時間4 s，間歇7 s，100次)。分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.4 重組蛋白質(zhì)的純化與酶切

將誘導(dǎo)成功的陽性重組菌液接種于2 mL LB(含Amp)培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜。次日取1 mL菌液接種于100 mL LB(含Amp)培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6，加入終濃度為20 mmol·L-1的丙酸鈉，室溫、180 r·min-1誘導(dǎo)過夜。離心收集菌體細胞，加10 mL Lysis buffer重懸，加溶菌酶(1 mg·mL-1)混勻后冰浴30 min，低溫超聲破碎。破碎后低溫離心30 min，取40 μL上清制備SDS-PAGE分析樣品。剩余的上清液加到預(yù)前處理好的Ni-NTA，4 °C 200 r·min-1結(jié)合60 min，將上清-Ni-NTA混合物分為2份，一份用5倍體積的Wash buffer洗3次，最后用0.5 mL Elution buffer洗脫靶蛋白4次，收集4次的洗脫液。另外一份直接加入2 mL Wash buffer(含TEV酶) 4 °C振蕩酶切過夜，次日低速離心取上清。分別吸取40 μL的洗脫液及TEV酶切后的上清液，加入等體積2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，沸水煮10 min，-20 °C保存。

1.5 c-di-GMP的合成及鑒定

1.5.1 標準品及底物溶液的配制 精確稱取一定量c-di-GMP及GTP，用水溶解配成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的標準品溶液及100 mmol·L-1的底物溶液。

1.5.2 c-di-GMP的合成 純化的VC0179重組蛋白通過BCA蛋白濃度測定后，取1.2 μmol·L-1VC0179與2 mmol·L-1的GTP在含5 mmol·L-1MgCl2和20 mmol·L-1HEPES的緩沖液中37 ℃反應(yīng)2 h。

1.5.3 液相色譜條件 Venusil XBP C18(L)色譜柱(5 μmol·L-1，250×4.6 mm，Agela)；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：25 ℃。流動相：乙酸銨(A)-甲醇(B)，采用線性梯度洗脫：流動相在45 min之內(nèi)從95% A+5% B逐漸降至50% A + 50% B。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

酶切獲取VC0179和丙酸誘導(dǎo)型載體的線性片段(圖1 A)，連接轉(zhuǎn)化后挑取陽性菌落雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符(圖1 B)。陽性克隆測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達及可溶性鑒定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)，20 mmol·L-1丙酸鈉室溫誘導(dǎo)過夜。取2 mL菌液離心后觀察菌體為紅色。超聲破碎誘導(dǎo)后菌體分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的全菌和上清樣品在72 ku處均有一明顯的條帶(圖2)。結(jié)果表明，成功誘導(dǎo)表達重組蛋白且為可溶性表達。

M.5 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標準；1.pMD-19-VC0179酶切后的片段(目的片段為小片段)；2.pMD-19-VC0179原質(zhì)粒；3.丙酸誘導(dǎo)型載體酶切后的片段(目的片段為大片段)；4.丙酸誘導(dǎo)型載體原質(zhì)粒；5～8.重組質(zhì)粒M.DL5000 DNA marker；1.Product of pMD-19-VC0179 digested by BamHⅠ and XhoⅠ(The target fragment is the shorter one)；2.Plasmid of pMD-19-VC0179；3.Product of propionate-inducible vector digested by BamHⅠ and XhoⅠ (The target fragment is the larger one)；4.Plasmid of propionate-inducible vector；5-8.Recombinant plasmids圖1 酶切獲取VC0179與丙酸誘導(dǎo)型載體線性片段及重組質(zhì)粒BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定Fig.1 Target fragment of VC0179 and propionate-inducible vector by restriction enzyme and identification of recombinant plasmid digested by BamHⅠ and XhoⅠ

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌總蛋白質(zhì)；2.誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌總蛋白質(zhì)；3.誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌超聲破碎的上清液；4.誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌超聲破碎的沉淀；5.未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌超聲破碎的上清液；6.未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌超聲破碎的沉淀M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of uninduced BL21(DE3) with recombinant plasmid；2.Total protein of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；3.Supernatant after ultrasonic of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；4.Inclusion after ultrasonic of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；5.Supernatant after ultrasonic of uninduced BL21(DE3) with recombinant plasmid；6.Inclusion after ultrasonic of uninduced BL21(DE3) with recombinant plasmid圖2 VC0179重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant VC0179 expression in E.coli BL21(DE3)

2.3 重組蛋白質(zhì)的純化與酶切

取處理好的各個樣品10 μL，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳(圖3)?？捡R斯亮藍染色結(jié)果顯示，純化后獲得較高純度的重組蛋白質(zhì)，TEV酶成功切除重組蛋白質(zhì)中的融合標簽，獲得VC0179靶蛋白。

2.4 c-di-GMP的合成及鑒定

高效液相色譜生成報告顯示(圖4)：VC0179重組蛋白體外酶促反應(yīng)生成產(chǎn)物的出峰時間與c-di-GMP標準品出峰時間一致。結(jié)果表明本試驗所獲得的重組蛋白質(zhì)具有功能活性，可在體外一步法生成c-di-GMP。

3 討 論

VC0179是人們發(fā)現(xiàn)的首個可以在革蘭陰性菌中合成c-di-AMP、c-di-GMP、c-GAMP的一種新型的雙核苷酸環(huán)化酶[1]。VC0179作為環(huán)化酶可有效促進霍亂弧菌的腸道定殖，同時還可調(diào)節(jié)趨化性的細菌定殖[1]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞在轉(zhuǎn)染dsDNA或DNA病毒侵染后也可生成c-GAMP，c-GAMP與STING結(jié)合后活化TBK1-IRF3信號通路介導(dǎo)Ⅰ型干擾素應(yīng)答[10]。c-di-GMP也可通過該信號通路誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達[11]。研究證實c-di-GMP可作為一種疫苗佐劑促進黏膜途徑的免疫[12-13]。鑒于VC0179的合成產(chǎn)物在先天性免疫中的重要功能，本試驗構(gòu)建了VC0179原核表達載體對其進行表達及純化，旨于建立一種穩(wěn)定獲得可溶性表達的有活性的VC0179重組蛋白的方法，進而用于體外酶促反應(yīng)研究。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.誘導(dǎo)前重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌總蛋白質(zhì)；2.誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌總蛋白質(zhì)；3.誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒BL21(DE3) 菌超聲破碎的上清液；4.純化的重組蛋白質(zhì)；5.TEV酶切后的VC0179蛋白M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of BL21(DE3) with recombinant plasmid before induction；2.Total protein of induced BL21(DE3) with recombinant plasmid by propionate；3.Supernatant after ultrasonic of induced BL21(DE3) with recombinant VC0179 plasmid by propionate；4.Puried recombinant protein；5.VC0179 protein after TEV cleavage圖3 純化及TEV酶切后VC0179重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purification and TEV cleavage of VC0179 recombinant protein

本試驗構(gòu)建的VC0179原核表達載體可使重組蛋白在E.coil中大量廉價表達，便于分離純化，避免了對包涵體變性復(fù)性處理，為純化保持VC0179活性提供保證。本試驗雖然成功獲得c-di-GMP，但最佳的合成條件還需進一步摸索以提高GTP的利用率及產(chǎn)量。B.W.Davies等[1]曾用RPHPLC、LCMS、MS/MS、變性凝膠電泳等多種方法檢測VC0179的體外合成產(chǎn)物c-di-AMP、c-di-GMP及c-GAMP。本試驗僅用高效液相色譜法檢測VC0179體外合成產(chǎn)物，更加簡便低成本的檢測手段還有待進一步研究。

圖4 高效液相色譜Fig.4 Chromatograms of high performance liquid chromatography

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建VC0179丙酸誘導(dǎo)型原核表達載體，并建立獲得有活性VC0179重組蛋白的方法。c-di-GMP的體外合成為后續(xù)c-di-GMP功能研究奠定基礎(chǔ)。

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(編輯 白永平)

Prokaryotic Expression and Activity Analysis of DncV fromVibrioCholera

HAN Ying-qian，KONG Jiang-nan，WANG Jiang，ZHANG Chao，YANG Guo-yu*

(KeyLaboratoryofAnimalBiochemistryandNutrition，MinistryofAgriculture，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

DncV(VC0179) is the member of a new family of di-nucleotide cyclases inVibriocholeraand it can catalyzes the synthesis of c-di-AMP，c-di-GMP and c-GAMP.c-di-GMP serves as the second messenger molecule to activate the innate immunity through STING signaling pathway.To generate c-di-GMP in vitro and further investigate its functions，we constructed the propionate-inducible VC0179 prokaryotic expression plasmid fused with cherry-Tag.The recombinant plasmid was transformed intoE.coilBL21(DE3) and induced by propionate.The expression of recombinant protein was observed by red color.SDS-PAGE analysis was used to identify the soluble expression of recombinant protein after ultrasonic decomposition.Moreover，c-di-GMP was enzymatically synthesizedinvitrowith the recombinant protein purified by Ni-NTA purification system and detected by high performance liquid chromatography.We successfully constructed the propionate-inducible VC0179 prokaryotic expression plasmid and acquired the high quality fusion protein，which could catalyze the synthesis of c-di-GMPinvitroby a one-step process.These results suggested that we established a method to generate enzymatically active VC0179 recombinant protein.The synthesis of c-di-GMPinvitrocould facilitate the functional study and high volume production of c-di-GMP.

VC0179；c-di-GMP；prokaryotic expression；enzymatic synthesis；high performance liquid chromatography

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.05.026

2014-09-09

農(nóng)業(yè)部948重點計劃(2011-G35)；河南省重點科技攻關(guān)(112102310705)

韓瑩倩(1990-)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士生，主要從事動物生物技術(shù)研究，E-mail：twgjl@163.com

*通信作者：楊國宇，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：haubiochem@163.com

S852.61

A

0366-6964(2015)05-0868-05