彭 瑛，鄧正華，溫先勇

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

慢性乙型肝炎患者治療前后乙型肝炎病毒YMDD突變情況分析

彭 瑛，鄧正華，溫先勇

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州646000）

目的采用Taqman熒光探針技術(shù)對(duì)慢性乙型肝炎（乙肝）患者血清中乙肝病毒P基因區(qū)550位點(diǎn)的突變情況進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)該院慢性乙肝患者乙肝病毒YMDD突變情況進(jìn)行調(diào)查，為指導(dǎo)臨床使用拉米夫定對(duì)乙肝患者進(jìn)行治療提供重要的參考依據(jù)。方法2013年2～12月選取HBVDNA定量在2.00E+03 IU以上的慢性乙肝患者186例，其中90例未經(jīng)過治療（未治療組），96例使用拉米夫定治療1年以上（治療組）。其血清采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)，分C、I、V三組，分別對(duì)總HBVDNA（包括野生型和突變型DNA），YIDD突變DNA，YVDD突變DNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果186例慢性乙肝患者中發(fā)生P基因區(qū)變異者共87例，其中治療組患者發(fā)生YIDD變異9例（9.4%），發(fā)生YVDD變異36例（37.5%），YIDD和YVDD同時(shí)變異6例（6.2%）；未治療組患者發(fā)生YIDD變異6例（6.7%），發(fā)生YVDD變異24例（26.7%），YIDD和YVDD同時(shí)變異6例（6.7%）。兩組患者YIDD變異、YVDD變異及YIDD和YVDD同時(shí)變異發(fā)生情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.011、0.156、0.206，P＞0.05）。結(jié)論經(jīng)過拉米夫定治療的患者乙肝病毒P基因區(qū)發(fā)生變異的頻率高，但未經(jīng)治療的慢性乙肝患者體內(nèi)的乙肝病毒也可自然發(fā)生P基因區(qū)的變異，故在治療前及治療中進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床治療用藥具有重要意義。

肝炎，乙型，慢性； 肝炎病毒，乙型； 拉米夫定； DNA，病毒

拉米夫定是核苷類抗病毒藥物，已廣泛應(yīng)用于慢性乙型肝炎患者的抗病毒治療，它與乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶結(jié)合后，競(jìng)爭(zhēng)性抑制多聚酶活性，使HBVDNA鏈的合成終止，從而有效地抑制HBV DNA的復(fù)制[1]。但是長(zhǎng)期服用拉米夫定的患者會(huì)引起病毒變異而產(chǎn)生耐藥性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，變異主要發(fā)生在HBV DNA多聚酶酪氨酸（Y）、甲硫氨酸（M）、天門冬氨酸（D）、天門冬氨酸（D），即YMDD基序區(qū)，即由異亮氨酸（I）取代甲硫氨酸（M）和由纈氨酸（V）取代甲硫氨酸（M）產(chǎn)生YIDD和

YVDD變異[2]。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熒光法定性檢測(cè)乙型肝炎患者血清中與拉米夫定耐藥有關(guān)的HBV DNA多聚酶基因YMDD突變（YMDD變異為YIDD或YVDD，即550ATG變異為GTG及550ATG變異為ATT），對(duì)本院慢性乙型肝炎患者HBV DNA多聚酶YMDD突變情況進(jìn)行分析，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 本研究186例患者均為2013年2～12月在本院臨床治療的慢性乙型肝炎患者，其中男116例，女70例，年齡19～76歲，實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)HBV DNA結(jié)果都在2.00 E+03 IU以上。接受拉米夫定治療1年以上者96例（治療組），未接受治療者90例（未治療組）。對(duì)乙型肝炎的診斷均符合2000年中華傳染病與寄生蟲病分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)修訂的病毒性肝炎防治方案的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑 美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司生產(chǎn)的ABI7500 fastRT熒光定量PCR儀；上海生物科技有限公司乙型肝炎病毒YMDD基因突變?cè)噭┖小?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣本采集用生化促凝真空管取患者靜脈血5mL，3 000 r/min離心10min，取血清200μL，-20℃凍存待用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.2.1 樣本的處理 嚴(yán)格按照說明說在生物安全柜中操作。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增 分3管進(jìn)行平行檢測(cè)，其中C檢測(cè)管檢測(cè)樣本中的總HBVDNA，包括野生型和突變型DNA，I檢測(cè)管檢測(cè)YIDD突變DNA，V檢測(cè)管檢測(cè)YVDD突變DNA，并使用dUTP和UNG酶防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。將25μL反應(yīng)體系置于ABI7500熒光PCR擴(kuò)增儀上。PCR擴(kuò)增條件：50℃2min，94℃保溫5min，再按94℃20 s、53℃30 s循環(huán)40次，53℃30 s處收集熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

186例慢性乙型肝炎患者中發(fā)生P基因區(qū)變異者共有87例，其中治療組發(fā)生YIDD變異9例，發(fā)生YVDD變異36例，YIDD和YVDD同時(shí)變異6例；未治療組發(fā)生YIDD變異6例，發(fā)生YVDD變異24例，YIDD和YVDD同時(shí)變異6例。兩組患者YIDD變異、YVDD變異及YIDD和YVDD同時(shí)變異發(fā)生情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.011、0.156、0.206，P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者發(fā)生P基因區(qū)變異情況比較[n（%）]

3 討 論

乙型肝炎是由HBV引起的一種全球肆虐的疾病，我國(guó)是世界上HBV感染最嚴(yán)重的國(guó)家，嚴(yán)重威脅著人類的健康。拉米夫定是具有強(qiáng)大抑制病毒復(fù)制作用的新一代核苷類藥物，該藥是RNA逆轉(zhuǎn)錄酶的有效抑制劑，通過抑制HBV DNA聚合酶而減少?gòu)?fù)制中間體，阻斷cccDNA的合成，使HBV感染不能持續(xù)[3]。其作用：（1）降低HBV DNA的濃度；（2）改善肝臟組織的病變；（3）可能阻斷肝纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展；（4）不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響；（5）可口服，不良反應(yīng)小[4]。除 HBV感染者YMDD存在自然變異外，長(zhǎng)期服用拉米夫定會(huì)出現(xiàn)HBV基因變異而產(chǎn)生耐藥。目前比較明確與耐藥相關(guān)的主要是HBV DNA多聚酶活性YMDD基因序列的變異，即HBV中蛋氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）取代，形成YVDD（即第550位核苷酸甲硫氨酸被異亮氨酸取代）YIDD變異（即第550位核苷酸甲硫氨酸被纈氨酸取代）。該部位正是拉米夫定干擾HBV復(fù)制的結(jié)合點(diǎn)，該區(qū)的基因突變導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變，空間構(gòu)象隨之改變，拉米夫定無法與之結(jié)合，喪失了抗病毒活性。

隨著HBV治療藥物拉米夫定的廣泛使用，HBV耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)已成為臨床應(yīng)用的一個(gè)棘手問題，盲目用藥只會(huì)導(dǎo)致耐藥情況加重，有效測(cè)定HBV耐藥相關(guān)DNA突變成為指導(dǎo)HBV臨床用藥，提高治療效率，降低費(fèi)用的重要手段，于是耐藥基因檢測(cè)方法的研究成為熱點(diǎn)。有研究證實(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)HBV DNA及YMDD變異，無須使用外在定量標(biāo)準(zhǔn)，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床實(shí)驗(yàn)室開展拉米夫定耐藥性突變的監(jiān)測(cè)[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用PCR Taqman熒光定量PCR技術(shù)，分C、I、V三組，分別對(duì)總HBV DNA（包括野生型和突變型DNA），YIDD突變DNA，YVDD突變DNA進(jìn)行檢測(cè)。通過研究結(jié)果可以看出186例慢性乙型肝炎患者中發(fā)生P基因區(qū)變異者共有87例，占46.8%。其中經(jīng)拉米夫定治療的患者發(fā)生YIDD變異者9例，占9.4%，發(fā)生YVDD變異者36例，占37.5%，YIDD和YVDD同時(shí)變異者6例，占6.2%；未治療患者發(fā)生YIDD單一變異者6例，占6.7%，發(fā)生YVDD變異者24例，占26.7%，YIDD和YVDD同時(shí)變異者6例，占6.7%。可見經(jīng)拉米夫定治療后發(fā)生變異的頻率更高，其中以YVDD變異最多，其次為YIDD變異及YIDD+YVDD變異，與普冬等[6]報(bào)道相近。未經(jīng)治療的慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的HBV也可自然發(fā)生P基因區(qū)的變異，與相關(guān)報(bào)道相符[7-10]。兩組患者YIDD變異、YVDD變異及YIDD和YVDD同時(shí)變異發(fā)生情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，YMDD變異株的發(fā)生會(huì)影響拉米夫定的抗病毒效果，因此在治療過程中進(jìn)行YMDD變異的檢測(cè)是非常必要的。必須指出的是，由于存在YMDD自然突變，所以對(duì)進(jìn)行抗病毒治療前的患者，也應(yīng)檢測(cè)有無YMDD變異，以便指導(dǎo)臨床醫(yī)生科學(xué)合理地制訂抗病毒治療方案，從而達(dá)到更好的療效。

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Analysisof HBV YMDDmutations in patientsw ith chronic hepatitis B before and after lam ivudine therapy

Peng Ying，Deng Zhenghua，Wen Xianyong
（Departmentof Laboratory Medicine，the Affiliated Hospitalof LuZhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveA totalof550 locusmutationsofhepatitis B virus in the Pgene regionwas detected by Taqman fluorescentprobe among the patients′serum with chronic hepatitis B.A survey on patientswith hepatitis B virus YMDDmutations in this hospitalwere conducted to guide the clinical use of lamivudine and provide an provide an important reference in clinic.MethodsItwas collected 186 chronic HBV patients from February to December of2013，whose HBV DNA quantification was more than 2.00E+03 IU，inwhich，90 patientswere deemed as the non-treatmentgroup and 96 as the treatmentgroup with lamivudine for over 1 year.These patients′serum was detected by polymerase chain reaction combined with Taqman fluorescent probe and divided into group C，Iand V，and detecting their total HBV DNA（thewild-type andmutantDNA），YIDDmutantDNA and YVDDmutantDNA respectively.ResultsTherewere 87 caseswith Pgene variation among the 186 patientswith chronic HBV，in which，9 cases in the treatmentgroup had YIDD variation，accounting for9.4%，36 cases occurred YVDD variation，accounting for 37.5%，6 with YIDD and YVDD variation，accounting for 6.2%；6 cases in the non-treatment group had YIDD variation，accounting for 6.7%，24 cases occurred YVDD variation，accounting for 26.7%，6 with YIDD and YVDD variation，accounting for 6.7%.The variations of YIDD，YVDD and YIDD&YVDD were compared simultaneously.The differencewas statistically significant（χ2=0.011，0.156，0.206，P＞0.05）.ConclusionThe patients treated by lamivudinewere ofhigh occurrence ofmutations in hepatitis B virus Pgene region.The chronic hepatitis B patientswithout the treatmentoccurred naturally variation of hepatitis B virusPgene region.Therefore，detecting drug-resistantgene before orduring the treatment is important in guiding clinical therapy.

Hepatitis B，chronic； HepatitisB virus； Lamivudine； DNA，viral

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.012

：A

：1009-5519（2015）07-0991-02

2014-11-15）

彭瑛（1977-），女，四川瀘州人，碩士研究生，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作；E-mail：850771970@qq.com。