朱 遠(yuǎn)，關(guān) 杰，田月強(qiáng)，李 莉，平牧野，任軍偉，鄧新立，叢玉隆

1解放軍總醫(yī)院 南樓檢驗(yàn)科，北京 100853；2北京大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100034；3兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100089

標(biāo)本放置時(shí)間對(duì)PL-11檢測(cè)血小板功能的影響

朱 遠(yuǎn)1，關(guān) 杰2，田月強(qiáng)1，李 莉1，平牧野1，任軍偉3，鄧新立1，叢玉隆1

1解放軍總醫(yī)院 南樓檢驗(yàn)科，北京 100853；2北京大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100034；3兵器工業(yè)北京北方醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100089

目的探討標(biāo)本在室溫保存時(shí)，不同放置時(shí)間對(duì)血小板功能檢測(cè)儀PL-11結(jié)果的影響。方法采集我院2012級(jí)學(xué)員隊(duì)20位健康學(xué)員及2013年我院門診20位服用氯吡格雷和阿司匹林的冠心病患者肘靜脈枸櫞酸鈉抗凝全血，應(yīng)用PL-11分別在采血后不同保存時(shí)間點(diǎn)(2 h、4 h、8 h)測(cè)定不同血小板活化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集率。結(jié)果健康組：以花生四烯酸(arachidonic acid，AA)為血小板活化誘導(dǎo)劑時(shí)，2 h、4 h、8 h的放置時(shí)間對(duì)血小板聚集功能未產(chǎn)生影響(P＞0.05)；二磷酸腺苷(adenosine di-phosphate，ADP)為誘導(dǎo)劑時(shí)，血小板聚集率在4 h明顯降低(P＜0.01)，8 h時(shí)已經(jīng)降低至4.3%(P＜0.01)；膠原(collagen，Col)誘導(dǎo)的血小板聚集率在采血后4 h時(shí)較2 h明顯降低(P＜0.01)，但與8 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。服用抗血小板藥物組：AA誘導(dǎo)的血小板聚集率2 h、4 h、8 h兩兩差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率在4 h時(shí)明顯降低(P＜0.01)，4 h與8 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Col誘導(dǎo)的血小板聚集率在8 h后出現(xiàn)明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論枸櫞酸鹽抗凝血標(biāo)本采集后放置時(shí)間對(duì)PL-11血小板功能檢測(cè)存在影響，在檢測(cè)健康人組或已服用雙聯(lián)抗血小板藥物患者組時(shí)，AA誘導(dǎo)血小板聚集受時(shí)間影響較小，ADP與膠原誘導(dǎo)血小板聚集時(shí)隨著標(biāo)本放置時(shí)間延長(zhǎng)，血小板聚集率降低。結(jié)合凝血功能檢測(cè)對(duì)枸櫞酸鹽抗凝血的要求，PL-11檢測(cè)血小板功能時(shí)，AA誘導(dǎo)聚集可在采血后4 h內(nèi)完成，ADP與膠原誘導(dǎo)應(yīng)在采血后2 h內(nèi)完成。

血小板聚集功能；質(zhì)量控制；PL-11；放置時(shí)間

冠心病患者在服用抗血小板藥物治療時(shí)，實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)行血小板功能檢測(cè)以監(jiān)測(cè)抗血小板治療。血小板功能檢測(cè)儀PL-11是一種通過庫(kù)爾特原理連續(xù)計(jì)數(shù)活化前后血小板數(shù)來評(píng)估血小板功能的檢測(cè)方法。目前已有研究認(rèn)為該方法可監(jiān)測(cè)抗血小板治療[1-2]，但尚無對(duì)該方法質(zhì)量控制方面的報(bào)道。本研究通過分析不同標(biāo)本放置時(shí)間對(duì)PL-11檢測(cè)血小板功能的影響，為PL-11血小板功能分析質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

資料和方法

1 對(duì)象 征集我院2012級(jí)學(xué)員隊(duì)男學(xué)員20名，平均年齡(28.6±6.1)歲，平均血小板數(shù)(215.7± 58.8)×109/L。另選擇2013年我院心內(nèi)科門診確診為冠心病并同時(shí)服用阿司匹林及氯吡格雷的男性患者20例，平均年齡(62.4±13.9)歲，平均血小板數(shù)(217.4±71.0)×109/L。

2 儀器與試劑 南京英諾華醫(yī)療科技有限公司的PL-11血小板功能分析儀及配套花生四烯酸試劑(arachidonic acid，AA)(濃度2 g/L)，二磷酸腺苷試劑(adenosine di-phosphate，ADP)(1 mmol/L)，膠原試劑(collagen，Col)(2 mg/ml)；真空采血管為3.2%枸櫞酸鹽抗凝管，購(gòu)自美國(guó)B.D公司；1 ml移液槍，200μl移液槍。

3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 采集每位受試者3管枸櫞酸鹽抗凝全血，置于室溫保存，分別在采血后2 h、4 h、8 h使用PL-11對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)試。吸取0.5 ml枸櫞酸鹽抗凝全血至PL-11檢測(cè)試管開始檢測(cè)。PL-11在計(jì)數(shù)血小板基礎(chǔ)值后，自動(dòng)加入一種血小板活化誘導(dǎo)劑(ADP 40μl最終濃度：4 mmol/L；AA 25μl最終濃度：0.3 mmol/L；Col 40μl，最終濃度：0.16 mg/L)，間隔一定混勻時(shí)間后連續(xù)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，得到最低血小板計(jì)數(shù)值，結(jié)果以最大血小板聚集率表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。檢測(cè)數(shù)據(jù)以表示，多組數(shù)據(jù)間比較使用ONE-WAY ANOVA方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

兩組血小板聚集率，健康對(duì)照組由AA誘導(dǎo)的PL-11最大血小板聚集率(%)分別為82.7%±7.2% (2 h)、82.8%±7.5%(4 h)、75.8%±14.6%(8 h)，不同放置時(shí)間最大血小板聚集率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；由ADP誘導(dǎo)的最大血小板聚集率(%)分別為70.6%±7.8%(2 h)、58.8%±9.8%(4 h)、4.3%±0.4%(8 h)，各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；由Col誘導(dǎo)的最大血小板聚集率(%)分別為75.1%±7.9%(2 h)、50.1%±16.1%(4 h)、45.1%± 14.4%(8 h)，2 h與4 h，2 h與8h間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？寡“逅幬锝M，由AA誘導(dǎo)的PL-11最大血小板聚集率(%)分別為30.1%±11.0% (2 h)、27.3%±8.9%(4 h)、26.3%±7.9%(8 h)，不同時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；由ADP誘導(dǎo)的最大血小板聚集率(%)分別為48.2%±10.9%(2 h)、34.8%±12.1%(4 h)、28.5%±6.5%(8 h)，2 h與4 h，2 h與8 h間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；由Col誘導(dǎo)的最大血小板聚集率(%)分別為41.3%±15.2% (2 h)、35.3%±10.5%(4 h)、30.5%±7.1%(8 h)，僅2 h與8 h間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖1。

圖 1 放置時(shí)間對(duì)血小板聚集率的影響Fig. 1 Effects of storage time on platelet aggregation A: healthy group; B: treatment group,aP＜0.01

討 論

20世紀(jì)初，Duke[3]首次利用出血時(shí)間間接檢評(píng)估小板功能。后來的研究認(rèn)識(shí)到在病理狀態(tài)下，活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用[4]，血流切變力增高(＞5 000/s)等因素，均可直接活化血小板，引起該部位血小板活化誘導(dǎo)劑的形成與釋放，包括花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧化酶(COX)作用形成的血栓烷A2(TxA2)、二磷酸腺苷和膠原等，最終形成血栓。因此檢測(cè)血小板功能成為了解血栓風(fēng)險(xiǎn)和監(jiān)測(cè)抗血小板治療的一種方法。PL-11是一種通過計(jì)數(shù)血小板活化前后數(shù)量來判斷血小板聚集功能的檢測(cè)方法。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道該方法與經(jīng)典光比濁法在監(jiān)測(cè)抗血小板治療時(shí)具有較好相關(guān)性及重復(fù)性[1-2,5-6]，但PL-11的檢測(cè)前質(zhì)量控制如標(biāo)本放置時(shí)間、放置溫度、試劑濃度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響尚未有報(bào)道。本文主要研究樣本在檢測(cè)前放置時(shí)間對(duì)PL-11的影響。

光比濁法檢測(cè)血小板功能應(yīng)在室溫進(jìn)行，檢測(cè)時(shí)間最好為采血后30 min ～ 2 h，不能超過4 h[7-8]。因此我們研究了在2 h、4 h、8 h時(shí)PL-11檢測(cè)血小板聚集功能的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AA為血小板活化誘導(dǎo)劑時(shí)，血標(biāo)本放置2 h、4 h、8 h后血小板聚集率無明顯差異，因此對(duì)于AA為誘導(dǎo)劑的血小板功能檢測(cè)時(shí)血液標(biāo)本保存可在4 h內(nèi)檢測(cè)。當(dāng)以ADP為誘導(dǎo)劑時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)血小板聚集率在4 h明顯降低，8 h時(shí)已經(jīng)降低至4.3%。這可能與低濃度ADP刺激血小板聚集后易發(fā)生解聚有關(guān)。因此當(dāng)以ADP為誘導(dǎo)劑時(shí)，PL-11檢測(cè)血小板聚集率應(yīng)在2 h內(nèi)完成檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率在采血后4 h時(shí)較2 h時(shí)明顯降低，膠原為誘導(dǎo)劑的檢測(cè)也應(yīng)于2 h內(nèi)完成。這與之前關(guān)于標(biāo)本放置時(shí)間對(duì)光比濁法的影響研究是一致的[9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PL-11在2 h時(shí)測(cè)健康組血小板聚集率高于治療患者組，證實(shí)阿司匹林與氯吡格雷對(duì)患者血小板功能抑制的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)有效性。服藥患者組中，AA誘導(dǎo)的血小板聚集率在2 h、4 h、8 h均無明顯差異，Col誘導(dǎo)的血小板聚集率在8 h時(shí)出現(xiàn)明顯降低，結(jié)果與健康組相似。ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率在4 h時(shí)明顯降低，這與之前文獻(xiàn)有相似的結(jié)果[10]，該研究中以ADP為誘導(dǎo)劑，標(biāo)本放置3 h時(shí)較采血后立即檢測(cè)降低近50%。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，ADP為誘導(dǎo)劑時(shí)，4 h與8 h無明顯差異，且8 h時(shí)血小板聚集率明顯高于健康人組，可能是由于冠心病患者存在高血小板聚集率，即高血小板活化狀態(tài)下，盡管其已服用氯吡格雷抑制P2Y12受體，但在標(biāo)本放置時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)仍有較正常人高的血小板聚集率。因此，該結(jié)果提示放置時(shí)間對(duì)服用抗血小板藥物患者檢測(cè)結(jié)果有影響，且似乎與健康人不同，可進(jìn)一步驗(yàn)證標(biāo)本放置時(shí)間對(duì)服用抗血小板藥物狀態(tài)下健康人與冠心病患者的差異。

檢驗(yàn)前處理對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果影響重大，尤其是住院患者，病房采血時(shí)間較早(一般在早晨5：00 -6：00)，標(biāo)本送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)已經(jīng)過了實(shí)驗(yàn)測(cè)定的規(guī)定時(shí)間，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究結(jié)果提示，標(biāo)本放置時(shí)間對(duì)PL-11血小板功能檢測(cè)存在影響，在檢測(cè)健康人或已服用抗血小板藥物治療的患者時(shí)，AA誘導(dǎo)血小板聚集受時(shí)間影響較小，但ADP與膠原誘導(dǎo)血小板聚集隨著標(biāo)本放置時(shí)間延長(zhǎng)，血小板聚集率降低。因此，PL-11檢測(cè)血小板功能時(shí)，AA誘導(dǎo)應(yīng)在采血后4 h內(nèi)完成，ADP和Col誘導(dǎo)應(yīng)在采血后2 h內(nèi)完成。

1 Guan J， Cong Y， Ren J， et al. Comparison between a new platelet count drop method PL-11， light transmission aggregometry，VerifyNow aspirin system and thromboelastography for monitoring short-term aspirin effects in healthy individuals［J］. Platelets，2014， 26（1）： 25-30.

2 關(guān)杰，任軍偉，朱遠(yuǎn)，等.光學(xué)比濁法與連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法監(jiān)測(cè)血小板聚集功能的比較［J］ .解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（8）：838-841.

3 Duke WW. The relation of blood platelets to hemorrhagic disease. Description of a method for determining the bleeding time and the coagulation time and report of three cases of hemorrhagic disease relieved by transfusion［J］. JAMA， 1910， 55：1185-1192.

4 Massberg S， Brand K， Grüner S， et al. A critical role of platelet adhesion in the initiation of atherosclerotic lesion formation［J］. J Exp Med， 2002， 196（7）：887-896.

5 Zhang YT， Zhao YM， Ji SD， et al. Evaluation of a new method and instrument for detection platelet aggregation function and its clinical application［J］. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi， 2013， 21（3）：674-677.

6 關(guān)杰，李莉，朱遠(yuǎn)，等.PL-11兩種誘導(dǎo)劑監(jiān)測(cè)健康人服用氯吡格雷后的血小板功能變化［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（3）：238-240.

7 Harrison P， Mackie I， Mumford A， et al. Guidelines for the laboratory investigation of heritable disorders of platelet function［J］. Br J Haematol， 2011， 155（1）： 30-44.

8 Cattaneo M， Cerletti C， Harrison P， et al. Recommendations for the Standardization of Light Transmission Aggregometry： A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH［J/OL］. http：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/ jth.12231/abstract.

9 陳興明，李祖蘭，劉香玲，等.血標(biāo)本室溫放置時(shí)間對(duì)血小板聚集的影響［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（6）：76-77.

10 Johnston LR， Larsen PD， La Flamme AC. Methodological considerations for the assessment of ADP induced platelet aggregation using the Multiplate （R） analyser［J］. Platelets， 2013， 24（4）：303-307.

Effects of sample storage time on platelet function tested with PL-11 analyzer

ZHU Yuan1, GUAN Jie2, TIAN Yueqiang1, LI Li1, PING Muye1, REN Junwei3, DENG Xinli1, CONG Yulong1
1Department of Clinical Laboratory in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Clinical Laboratory, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China;3Department of Clinical Laboratory, Beijing North Hospital of China North Industrise Group Corporation, Beijing 100089, China

CONG Yulong. Email: yulongc@263.net

ObjectiveTo identify the effects of storage time on platelet function tested with PL-11 analyzer under room temperature.MethodsCitrated antecubital vein blood samples of graduate students in grade 2012 of Chinese PLA Medical School (n=20) and coronary heart disease (CHD) outpatients (n=20) treated with dual-antiplatelet drugs in the department of cardiology were drawn and tested by PL-11 analyzer at 3 testing points: 2, 4 and 8 hours after blooding. The maximum platelet aggregation ratio was tested with 3 different activators: arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP) and collagen.ResultsHealthy young men: AA-induced platelet aggregation ratio showed no difference between 2 h, 4 h and 8 h (P＞0.05). When ADP used as the activator, platelet aggregation ratio reduced apparently at 4 h compared with 2 h (P＜0.01), and it reduced to 4.3% at 8 h (P＜0.01). There was a clear reduction of collagen-induced platelet aggregation at 4 h compared with 2 h (P＜0.01), while no difference was found between 4 h and 8 h (P＞0.05). Patients treated with dual-antiplatelet drugs: AA-induced results showed no statistic difference between 2 h, 4 h and 8 h (P＞0.05). ADP-induced results showed an obvious reduction at 4 h, while no difference was found between 4 h and 8 h (P＞0.05). Collagen-induced aggregation ratio reduced apparently at 8 h after blood sampling (P＜0.01).ConclusionStorage time affects the results of PL-11 platelet function test with limited influence on AA-induced platelet aggregation ratio, whatever in healthy men or patients treated with dual-antiplatelet drugs. ADP- or collagen-induced platelet aggregation ratio reduces as the time delay extending. The time delay between collection, transport and analysis should ideally be preferable in 4 hours when AA used as activator or 2 hours when ADP and collagen used as activators. Keywords: platelet aggregation; pre-analysis control; PL-11; storage time

R 446.1

A

2095-5227(2015)06-0611-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.06.024

時(shí)間：2015-03-24 10:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150324.1013.002.html

2015-02-09

朱遠(yuǎn)，男，在讀碩士。Email: 3466591133@qq.com

叢玉隆，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。Email: yu longc@263.net