芮海波 趙學(xué)龍 王文曉 張國花

(1 南京市中醫(yī)院藥劑科,南京,210001; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210014)

HPLC法對(duì)杏桔合劑中桔梗皂苷D的含量測(cè)定研究

芮海波1趙學(xué)龍1王文曉2張國花2

(1 南京市中醫(yī)院藥劑科,南京,210001; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210014)

目的:建立杏桔合劑中桔梗皂苷D的含量測(cè)定方法，為杏桔合劑的質(zhì)量控制提供量化參考。方法：采用HPLC方法測(cè)定桔梗皂苷D的含量。結(jié)果：桔梗皂苷D在0.5～8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程:y=238632x+10382，r=0.9997，加樣回收率93.64%，RSD=1.54%。結(jié)論：應(yīng)用HPLC測(cè)定杏桔合劑中桔梗皂苷D含量的方法可行，可以作為其質(zhì)量控制的參考依據(jù)。

杏桔合劑；桔梗皂苷D；含量；HPLC

杏桔合劑為江蘇省南京市中醫(yī)院較早大量生產(chǎn)的濃縮劑之一,并收載于“南京市醫(yī)院制劑規(guī)范”中。該方為南京市中醫(yī)院所獨(dú)有，經(jīng)過歷屆醫(yī)家臨床使用和實(shí)踐證明療效確切。其處方由杏仁、陳皮、桔梗和甘草組成，功效為宣肺化痰。臨床上廣泛用于咳嗽、咽痛、咯痰不爽等。其中桔梗在宣肺化痰過程中起到很關(guān)鍵的作用，桔梗的主要活性成分為桔梗皂苷，桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷。通過確定桔梗皂苷D的含量，為杏桔合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供[1-10]。

1 材料與方法

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀(Waters 515泵,Waters 2996檢測(cè)器,Waters 717進(jìn)樣器)；HederaODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)；YP601N型電子天平(d=0.1 g)；BP211D型電子天平(精確度為十萬分之一)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Anke-TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；移液管；滴管；量筒；容量瓶等。

1.2 受試藥物 桔梗皂苷D對(duì)照品(批號(hào)：111851-201102,中國食品藥品檢定研究院)；陳皮(批號(hào)121216,產(chǎn)地江蘇)；甘草(批號(hào)130226,產(chǎn)地內(nèi)蒙古)；苦杏仁(批號(hào)121223,產(chǎn)地江蘇)；桔梗(批號(hào)130301,產(chǎn)地江蘇)。

1.3 試劑 磷酸(色譜純,南京化學(xué)試劑廠)；甲醇(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司)；乙腈(色譜純,湖北杜克化學(xué)科技有限公司)；無水乙醇(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯仿(分析純,上海凌風(fēng)化學(xué)試劑有限公司)；水為重蒸餾水(自制)。

2 方法

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液(3∶25∶72),檢測(cè)波長：204 nm,柱溫：25 ℃,流速：1 mL/min[11-13]。

2.2 桔梗皂苷D對(duì)照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品5.03 mg,置10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL含桔梗皂苷D 0.503 mg/mL的對(duì)照品溶液[11-13]。

2.3 供試品溶液的制備 按處方量的三分之一稱取各藥材,按照正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳工藝提取3份,將提取液濃縮至333 mL,分別加入適量的防腐劑苯甲酸鈉和對(duì)羥基苯甲酸乙酯,放置4 h,抽濾。參照2010版《中華人民共和國藥典》方法,取濾液20 mL,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次20 mL,合并正丁醇液,用氨試液50 mL洗滌,棄去氨液,再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌,棄去水液,正丁醇液蒸干,殘?jiān)蛹状? mL使溶解,加硅膠0.5 g拌勻,置水浴上蒸干,加于硅膠柱[100～120目,10 g,內(nèi)徑為2 cm,用三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液濕法裝柱]上,以三氯甲烷-甲醇(9∶1)混合溶液50 mL洗脫,棄去洗脫液,再用三氯甲烷-甲醇-水(60∶20∶3)混合溶液100 mL洗脫,棄去洗脫液,繼用三氯甲烷-甲醇-水(60∶29∶6)混合溶液100 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘?jiān)蛹状既芙?轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,即得[14-17]。

2.4 陰性樣品溶液的制備 取方中缺桔梗的其他藥材，按制劑工藝做成陰性樣品，精密稱取陰性樣品20 mL，按供試品溶液的方法制成陰性樣品溶液。

2.5 線性范圍的考察 取上述配制好的桔梗皂苷D對(duì)照品分別進(jìn)樣1、2、4、8、16 L，以進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得線性方程為y=238632x+10382，R2=0.9997。因此桔梗皂苷D在0.5～8 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好[18]。(見圖1)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各4 L，按上述色譜條件分別進(jìn)行檢測(cè)，色譜圖如下。結(jié)果陰性樣品溶液色譜中，在與對(duì)照品和樣品中桔梗皂苷D相同的出峰位置無色譜峰，表明處方中其他成分對(duì)測(cè)定無干擾[19]。(見圖2、3、4)

圖2 桔梗皂苷D對(duì)照品

2.7 精密度試驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下桔梗皂苷D對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次4 L，記錄峰面積，求得RSD為0.88%[20]。(見表1)

圖3 供試品溶液

圖4 陰性樣品溶液

序號(hào)峰面積RSD(%)160906108826008873601317460957356103386607584

由上表可知，儀器和方法的精密度良好，符合測(cè)定要求。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 從同一份供試品中量取6份，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按照色譜條件分別依法測(cè)定，每份重復(fù)測(cè)定兩次，每次進(jìn)樣10 L，記錄峰面積，求得RSD為1.85%[21]。(見表2)

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

上述結(jié)果表明，苦杏仁苷在該測(cè)定條件下，重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h依法測(cè)定6次，進(jìn)樣10 L，記錄峰面積，求得RSD為1.81%[22]。(見表3)

結(jié)果表明，供試品溶液中的苦杏仁苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定，符合測(cè)定要求。

2.10 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密量取6份已知桔梗皂苷D含量的樣品溶液10 mL，分別加入1.263 mg/mL的桔梗皂苷D對(duì)照品溶液1 mL，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，重復(fù)兩次，每次進(jìn)樣10 L，記錄桔梗皂苷D峰面積，計(jì)算得桔梗皂苷D回收率在90%～110%之間(n=6)，平均回收率為93.64%，RSD為1.47%[23-24]。(見表4)

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.11 含量測(cè)定 分別從提取的3批杏桔合劑中各取2份，共6份，按2.3項(xiàng)下制得供試品溶液，在2.1項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣10 L，記錄峰面積，帶入回歸方程計(jì)算樣品中桔梗皂苷D的含量。(見表5)

表5 含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所采用的測(cè)定方法測(cè)定桔梗皂苷D，重現(xiàn)性良好，回收率較高，且在該色譜條件下，桔梗皂苷D進(jìn)樣精密度良好，故該法結(jié)論可靠，可作為杏桔合劑中桔梗皂苷D含量測(cè)定的方法。

4 討論

查閱大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)桔梗皂苷D的含量測(cè)定方法基本上全采用高效液相色譜法，且多為反相色譜法，因此選用其中分離效果較好的HederaODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)。

對(duì)桔梗皂苷D的含量測(cè)定是在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示桔梗皂苷D在204 nm波長處有最大吸收且靈敏度最高，故選定其檢測(cè)波長為204 nm。

本品的主要成分桔梗皂苷D的含量檢測(cè)符合2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，通過確定其含量測(cè)定方法，增加了杏桔合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量化指標(biāo)，從而更好的保證合劑的質(zhì)量可靠性。

[1]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中藥匯編(上)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1988:1865.

[2]丁東寧,譚延華,劉俊儒,等.鎮(zhèn)原苦杏仁化學(xué)成分的研究[J].西北藥學(xué)雜志,1990,5(3):21-23.

[3]邢國秀,李楠,楊美燕,等.天然苦杏仁等的研究進(jìn)展[J].中成藥,2003,12(12):1007-1009.

[4]楊春,盧健鳴,梁霞,等.杏仁的營養(yǎng)價(jià)值與開發(fā)利用[J].山西食品工業(yè),1999,2(2):23-32.

[5]付文衛(wèi),竇德強(qiáng),裴月湖.桔梗的化學(xué)成分和生物活性研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(3):184-191.

[6]吳文君,單提昆,何嘉凝,等.桔梗皂苷化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理研究進(jìn)展.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2012,33(3):176-177.

[7]孫遠(yuǎn)志,何樹東.桔梗對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病臨床應(yīng)用概況[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2006,12(6):58-59.

[8]張巖,劉穎,陶韻文,等.傳統(tǒng)中藥材桔梗的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥,2013,37(7):638-639.

[9]楊壯,田景奎,張琳.比色法測(cè)定桔梗中桔梗總皂苷的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志,2008,25(1):58-60.

[10]郭文杰,許旭東,魏建和,等.桔梗中三萜皂苷類化學(xué)研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2008,43(11):801-803.

[11]Amagaya S,Sugishita E,Ogihara Y,et al.Comparative studies of the stereoisomers of glycyrrhetinic acid on anti inflammatory activities[J].J Pharmacobiodyn,1984,7(12):923.

[12]MatsuiS,MatsumotoH，Sonoda Y,et al.Glycyrrhizin and related compounds down-regμLate production of inflammatory chemokines IL-8 and eotaxin 1 in a human lung fibroblast cell line[J].Int Immunopharmacol,2004，4(13):1633.

[13]Zhang W,Lu C,Liu Z,et al.Therapeutic effect of combined triptolide and glycyrrhizin treatment on rats with collagen induced arthritis[J].PlantaMed,2007,73(4):336.

[14]吳碧元,孫軍,蔣紅芳.桔梗提取工藝的研究[J].中藥材,2002,25(6):430-432.

[15]上海藥物研究所.中草藥有效成分的提取和分離[M].上海:上海人民出版社,1972:284.

[16]郭麗,肖永慶,張村,等.桔梗藥材中桔梗皂苷D的定性定量方法研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(3):200-204.

[17]潘鵬翔.川杏合劑薄層色譜鑒別研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012,8(6):46-47.

[18]李洪燕,張蕊,馮曉川.HPLC-ELSD法測(cè)定復(fù)方枇杷止咳顆粒中桔梗皂苷D、熊果酸、齊墩果酸和貝母素甲[J].中成藥,2013,35(7):1479-1480.

[19]彭善貴,文永盛.HPLC-ELSD法測(cè)定桔梗冬花片中桔梗皂苷D的含量[J].中國藥師,2012,15(1):134-135.

[20]丁大勇,高菲,姚琳,等.HPLC-ELSD法測(cè)定桑菊感冒片中桔梗皂D的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2012,19(3):54-55.

[21]李喜鳳,杜云鋒,謝新年,等.不同產(chǎn)地桔梗藥材HPLC指紋圖譜及桔梗皂苷D含量測(cè)定研究[J].中成藥,2010,32(4):529-530.

[22]曲建啟,潘西芬,李以菊.高效液相法測(cè)定嬰兒止咳合劑中桔梗皂苷D的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(23):130-131.

[23]筆雪艷,劉曉鳳,張清波,等. 桔梗藥材及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(6):69-70.

[24]李俏陽.用HPLC法測(cè)定桔梗流浸膏中桔梗皂苦D含量的效果分析[J].求醫(yī)問藥,2013,11(8):268-269.

(2014-06-16收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

HPLC Method for Determination of Platycodin D in Apricot Orange Mixture

Rui Haibo1, Zhao Xuelong2, Wang Wenxiao2, Zhang Guohua2

(1ChineseHospitalofNanjing,Nanjing210001,China; 2NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210014,China)

Objective:To establish content determination method of platycodin D in apricot orange mixture so as to provide quantitative information for quality control of apricot orange mixture.Methods:HPLC was used to determine contents of platycodin D.Results:Platycodin D in the range 0.5 ～ 8ug had good linear relationship, and the regression equation was: y=238632x +10382, r=0.9997, recovery was 93.64%,RSD=1.54%.Conclusion:The method of HPLC to determine Platycodin D in apricot orange mixture is feasible, and it can be used as a reference for its quality control.

Apricot orange mixture; Platycodin D; Content; HPLC

南京市中醫(yī)院青年科研基金課題(編號(hào)：2011YJ006)

芮海波，男，主管中藥師，主要從事醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：157854957@qq.com

R284.1；R-331

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.027