何紅梅 屈莉紅 邵建國 陳琳 李民 張玲燕 顧春燕

清脂護(hù)肝方對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用研究

何紅梅 屈莉紅 邵建國 陳琳 李民 張玲燕 顧春燕

目的 探討清脂護(hù)肝方對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用及其機(jī)制。方法 58只雄性SD大鼠，均喂養(yǎng)高脂飼料，予12只作對照。將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組、低劑量、中劑量和高劑量清脂護(hù)肝方組，分別給予0.9%NaCl溶液灌胃，清脂護(hù)肝方組予清脂護(hù)肝方藥液灌胃6周；觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)及體質(zhì)量變化。干預(yù)結(jié)束后次日處死所有大鼠并留取血清和肝臟，檢測清脂護(hù)肝方對N A S H大鼠肝生化指標(biāo)的影響。免疫組織化學(xué)方法檢測N A S H大鼠肝組織中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)：對庫普弗細(xì)胞株采用不同濃度不同時(shí)間的C Cl4刺激，用優(yōu)選方案的清脂護(hù)肝方藥物血清培養(yǎng)后檢測SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達(dá)。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；模型組A L T、A ST、T Bil均較正常對照組升高（P＜0.05）；模型組T G、C H、L D L均明顯上升（P＜0.01），H D L亦有所降低（P＜0.05）。與模型組相比，中大劑量清脂護(hù)肝方組體質(zhì)量均有減輕，其中大劑量組的體質(zhì)量減輕最為明顯（P＜0.01）；清脂護(hù)肝方各劑量治療組A L T與模型組比較明顯降低（P＜0.01），大劑量治療組A ST與模型組比較明顯降低（P＜0.01）；清脂護(hù)肝方中、大劑量組的血清T Bil較模型組顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，清脂護(hù)肝方組的T G、L D L有所降低（P＜0.05），尤其大劑量組降低相對更明顯；清脂護(hù)肝方各劑量組C H有所降低，但僅有大劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IC C結(jié)果表明，Lyn、H ck在庫普弗細(xì)胞中有表達(dá)，并與炎癥程度呈正相關(guān)，清脂護(hù)肝方藥物血清培養(yǎng)后表達(dá)減少，F(xiàn)gr和SSeC K S在庫普弗細(xì)胞中無明顯表達(dá)。IC C結(jié)果表明，H ck、Lyn在正常肝臟組織中低表達(dá)，模型組中高表達(dá)，用藥組無論是大、中、小劑量組，在抑制H ck、Lyn兩種Src相關(guān)激酶成員的陽性表達(dá)方面有顯著效果，特別是大劑量組，與模型組比較有顯著意義（P＜0.01）；模型組SSeC K S蛋白的表達(dá)顯著低于正常對照組，在治療組中的表達(dá)介于模型組和正常對照組，同時(shí)伴隨Lyn、H ck表達(dá)的升高呈減少趨勢，提示SSeC K S 與Src家族相關(guān)激酶（Lyn、H ck）存在某種上下游抑制關(guān)系；而清脂護(hù)肝方對Fgr的表達(dá)無明顯影響，用藥前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 清脂護(hù)肝方能減輕肝臟的炎性反應(yīng)，明顯改善肝功能和血脂指標(biāo)，其機(jī)制可能與SSeC K S、Lyn、H ck信號通路有關(guān)，且高劑量時(shí)療效更優(yōu)。

清脂護(hù)肝方；非酒精性脂肪性肝炎；肝功能；血脂；SSeC K S、Lyn、H ck、Fgr

非酒精性脂肪性肝炎（N A S H）是指肝細(xì)胞脂肪變性、小葉和（或）匯管區(qū)炎性反應(yīng)，有時(shí)伴有M allory小體形成和肝纖維化的一種病理狀態(tài)。有關(guān)N A S H的發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未闡明，近年來的研究更傾向于“多重打擊論”的學(xué)說［1］。中醫(yī)認(rèn)為，N A S H乃濕、痰、瘀互阻而發(fā)病，根據(jù)其發(fā)病機(jī)制，遵循中醫(yī)學(xué)辯證施治的原則，清脂護(hù)肝方用于治療N A S H療效顯著［2］。

Src家族由Lyn相關(guān)激酶（Lyn、H ck、Lck和Blk）、Src相關(guān)激酶（Src、Yes、Fyn和Fgr）和3種Src家族激酶相關(guān)的激酶（Brk、Frk和Srm）等共11個(gè)成員組成［3］。它們構(gòu)型相似，有相同的功能域，共同參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，參與機(jī)體多種重要的生理功能。相關(guān)文獻(xiàn)表明，Src家族相關(guān)激酶中H ck、Lyn、Fgr主要存在于單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞中，并與庫普弗細(xì)胞的激活關(guān)系密切［4］；Src抑制的蛋白激酶c的底物（SSeC K S）是一種細(xì)胞骨架蛋白，調(diào)節(jié)蛋白激酶A（P K A）、蛋白激酶C（P K C）信號通路，在肝纖維化模型肝星狀細(xì)胞及肝臟炎癥組織中的庫普弗細(xì)胞中有一定的表達(dá)［5-6］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在L PS誘導(dǎo)的急性肝損傷中，SSeC K S表達(dá)上調(diào)，并與LPS呈劑量依賴關(guān)系（5 m g/kg表達(dá)最高），說明SSeC K S與肝臟的炎性反應(yīng)有關(guān)。腹腔注射C Cl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型發(fā)現(xiàn)，在活化的肝星狀細(xì)胞中，SSeC K S表達(dá)明顯增加；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SSeC K S參與星狀細(xì)胞的活化、肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展［5-7］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，H ck，Lyn在庫普弗細(xì)胞中有表達(dá)。本研究初步分析清脂護(hù)肝方可能會影響N A S H的相關(guān)指標(biāo)，包括肝功能、血脂、SSeC K S分子和H ck、Fgr、Lyn的表達(dá)，探討其對N A S H的影響及其機(jī)制。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

2月齡58只雄性SD大鼠（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量180～240 g）除對照組12只，其余均喂養(yǎng)高脂飼料［8］（80.5%普通飼料、2%膽固醇、12%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉）制備N A S H模型，8周后隨機(jī)抽取6只模型大鼠和2只正常大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，取下肝臟做病理切片，驗(yàn)證造模是否成功。將余下的40只造模成功的大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成模型組，清脂護(hù)肝方低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只；模型組和對照組均予以0.9%NaCl溶液灌胃，清脂護(hù)肝方組分別以2.43 g· kg-1·d-1、12.15 g·kg-1·d-1、24.3 g·kg-1·d-1灌胃6周，給藥期間均喂以正常飼料。

實(shí)驗(yàn)庫普弗細(xì)胞是R A W 264.7小鼠的細(xì)胞株，由上海仁濟(jì)醫(yī)院消化病研究所馬雄教授所贈與。

二、取材及標(biāo)本檢測

取正常對照組、模型組及清脂護(hù)肝方低劑量組、中劑量組、高劑量組肝組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，IH C法檢測肝組織中H ck、Lyn、Fgr、SSeC K S的表達(dá)。

三、檢測方法

1.肝功能及血脂：采用日本O L Y M P U S全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測。

2.IH C法檢測N A S H大鼠肝組織中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達(dá)水平：造模成功后取肝臟組織用中性甲醛溶液固定，處理，包埋，切片，脫蠟，組織片烤干后，脫色水化，熱修復(fù)（Tris-E D T A緩沖液p H 9.0抗原修復(fù)液購買于上?；蚩萍脊荆右豢梗↙yn抗體，1∶400，ab40660，A B C A M公司；SSeC K S抗體，1∶2000，ab49849，A B C A M公司；H ck抗體，1∶600，sc-72，S A N T A公司；Fgr抗體，1∶600，H 00002268-M 01，N O V U S公司）于4℃下過夜，次日加二抗（中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），1 h后用沖片，加D A B顯色劑（中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），在顯微鏡下觀察顯色情況，顯色后用蒸餾水終止染色，將顯色后的組織片放入蘇木素中復(fù)染1 min，自來水清洗5 min。將組織片依次放入100%乙醇，二甲苯1，二甲苯2中脫水，封片，顯微鏡下觀察及攝片。

3.IC C法檢測庫普弗細(xì)胞中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達(dá)水平：對庫普弗細(xì)胞株采用不同濃度不同時(shí)間的C Cl4刺激，用含20%清脂護(hù)肝方藥物血清培養(yǎng)后刺激固定爬片細(xì)胞，用蒸餾水洗滌細(xì)胞爬片5 min×1次，PBS浸泡5 min；滴加3%H2O2去離子水，室溫孵育30 min。PBS洗5 min×3次；滴加0.3% Triton X-100（全液用蒸餾水稀釋）通透30 min；PBS 洗5 min×3次；滴加一抗（Lyn 1∶600，H ck 1∶600，SSeC K S 1∶2000，F(xiàn)gr 1∶800），4℃過夜。PBS洗5 min×3次；滴加二抗，室溫1 h。PBS洗5 min×3次；D A B顯色液按A：（A+B）=1∶50配制，混勻，鏡下顯色觀察。蒸餾水終止；蘇木素染75 s。自來水充分沖洗；依次在75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→二甲苯中浸泡2 min脫水；封片，顯微鏡下觀察及攝片留圖。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料如呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，以±s表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較用方差分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠一般情況

模型組大鼠造模后出現(xiàn)急躁易激怒，活動(dòng)減少，腹部膨隆，精神不振，飲食量減少，尿色黃，便稀味臭，體質(zhì)量增加。正常對照組大鼠一般狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，體質(zhì)量增加，飲食及二便正常。治療組從治療給藥起，狀態(tài)好轉(zhuǎn)，大便逐漸正常，整體觀察介于模型組與正常對照組間。

二、清脂護(hù)肝方對N AS H大鼠肝功能及血脂的影響

1.肝功能：模型組大鼠A L T、A S T、T Bil均較正常對照組升高（P＜0.05）。清脂護(hù)肝方各劑量治療組A L T與模型組比較明顯降低（P＜0.01），大劑量治療組A S T與模型組比較明顯降低（P＜0.01），各組Alb水平無明顯差異。中、大劑量組的血清T Bil較模型組顯著下降（P＜0.01），但小劑量組較模型組無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

2.血脂：與正常對照組比較，模型組T G、C H、L D L均明顯上升（P＜0.01），H D L與模型組比較有所降低（P＜0.05），清脂護(hù)肝方組的T G、L D L有所降低（P＜0.05），尤其大劑量組降低相對更明顯，各治療組間H D L無明顯差異（P＞0.05）；清脂護(hù)肝方各劑量組C H均有所降低，見表2。

三、IC C法檢測SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達(dá)

Lyn、Hck在庫普弗細(xì)胞中有表達(dá)，并與炎癥程度呈正相關(guān)，清脂護(hù)肝方藥物血清培養(yǎng)后表達(dá)減少，F(xiàn)gr和SSeC KS在庫普弗細(xì)胞中無明顯表達(dá)。詳見圖1～圖4。

表1 清脂護(hù)肝方對各組大鼠肝功能的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

表2 清脂護(hù)肝方對各組大鼠血脂的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

四、IH C法檢測N A S H大鼠肝組織中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達(dá)

模型組SSeC K S蛋白在肝組織中的表達(dá)顯著低于正常組，在治療組中的表達(dá)介于模型組和正常對照組之間，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=8.004，P=0.601）；模型組的H ck、Lyn蛋白在N A S H大鼠肝組織中的表達(dá)顯著高于正常組，在治療組中的表達(dá)介于模型組和正常組，其中大劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中小劑量與模型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Fgr各組均為陰性表達(dá)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5～圖8。

討 論

清脂護(hù)肝方主要由9種中藥組成，其中黃連、黨參、黃芪和仙靈脾共為君藥，有清胃熱、健脾益氣、溫腎以助脾運(yùn)化痰之功；紅花、赤芍、川芎共為臣藥，有活血化瘀、行氣疏肝之功；枸杞子、生山楂為佐使藥，有調(diào)補(bǔ)肝腎、消食滯之效。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯增加，與模型組相比，中大劑量組體質(zhì)量均有減輕，其中大劑量組的體質(zhì)量減輕最為明顯，說明清脂護(hù)肝方有減輕體質(zhì)量的作用，可能與清脂護(hù)肝方中的山楂等有健脾消食的作用相關(guān)。

A L T是反映肝功能的可靠指標(biāo)，N A S H時(shí)因肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的脂肪變性及炎性反應(yīng)，肝功能受到損害，A L T升高，但若病變嚴(yán)重進(jìn)展到重癥肝壞死，肝細(xì)胞不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)氨酶，出現(xiàn)膽紅素明顯升高而A L T可僅輕度升高，這種“膽酶分離”常提示療效不良。但是A L T水平與肝臟病理改變沒有明確相關(guān)性。與正常對照組相比，模型組中A L T明顯升高，說明高脂飲食確實(shí)會損傷肝功能情況，清脂護(hù)肝方治療后A L T水平均有明顯下降。A S T除在心肌及骨骼肌中表達(dá)外，在肝細(xì)胞線粒體中也有表達(dá)，因此A S T也是反映肝功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果示模型組比正常對照組的A S T水平明顯升高，而不同劑量治療組在降低A S T方面起了重要作用。Alb、T Bil也是反映肝功能的重要指標(biāo)，T Bil在治療后也有明顯差異，主要體現(xiàn)在中大劑量組，而小劑量組并無明顯差異，Alb在正常組及模型組、模型組與治療組之間沒有明顯差異，且均在正常范圍內(nèi)，說明高脂處方未能改變大鼠的Alb指標(biāo)，考慮原因?yàn)樵炷r(shí)間的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組血清C H、T G、L D L水平較正常組升高（P ＜0.05），H D L較正常組降低（P＜0.05），治療組C H、T G水平明顯降低（P＜0.05），而H D L水平有增高的趨勢（P＞0.05），在降低C H、T G、L D L指標(biāo)方面治療組有良好效果，大劑量組相對更好。但治療前后未能增加H D L的表達(dá)，結(jié)合目前關(guān)于L D L、H D L尚未有明確參考標(biāo)準(zhǔn)，無法判斷實(shí)驗(yàn)前后大鼠內(nèi)L D L、H D L水平是否到達(dá)病理水平，所以亦無法評估清脂護(hù)肝方對此兩個(gè)指標(biāo)的影響。

對Src家族的檢測發(fā)現(xiàn)，H ck、Lyn在正常肝臟組織中低表達(dá)，模型組中高表達(dá)，用藥組無論是大、中、小劑量組，抑制Lyn、H ck表達(dá)有顯著效果，特別是大劑量組；推測清脂護(hù)肝方可能通過Lyn、H ck信號通路下調(diào)炎性因子的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗炎作用，且該作用與藥物劑量有關(guān)。模型組的SSeC K S蛋白表達(dá)顯著低于正常對照組，在治療組中的表達(dá)介于模型組和正常組，同時(shí)伴隨Lyn、H ck表達(dá)的升高呈減少趨勢，提示SSeC K S與Src家族相關(guān)激酶（Lyn、H ck）存在某種上下游抑制關(guān)系；表明清脂護(hù)肝方能提高SSeC K S的表達(dá)，從而減輕炎性反應(yīng)，且以大劑量組效果最好；而清脂護(hù)肝方對Fgr的表達(dá)無明顯影響。

綜上所述，清脂護(hù)肝方能減輕肝臟的炎性反應(yīng)，明顯改善肝功能和血脂，其機(jī)制可能與SSeC K S、Lyn、H ck信號通路有關(guān)，且高劑量時(shí)療效更優(yōu)。

1 巫協(xié)寧.非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制新說：多重打擊論和治療展望.中華消化雜志，2014，34：206-209.

2 李民，達(dá)坤林，徐建中，等.清脂護(hù)肝方治療非酒精性脂肪肝療效觀察.中國美容醫(yī)學(xué)，2010，19：23.

3 Ingley E.Src fa mily kinases：regulation of their activities，levels and identification of new path ways.Biochim Biophys Acta，2008，1784：56-65.

4 O kutani D，Lodyga M，H an B，et al.Src protein tyrosine kinase fa mily and acute infla m matory responses.A m J Physiol Lung Cell M ol Physiol，2006，291：129-141.

5 蔣文，宋磊，邵建國，等.肝星狀細(xì)胞SSeC K S的表達(dá)及其在肝纖維化中的作用.中華內(nèi)科雜志，2008，47：570-573.

6 黃曉冬，朱順星，劉海鷗.非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟SSeC K S的表達(dá).交通醫(yī)學(xué)，2009，23：465-467.

7 蔣文，邵建國，劉海歐等.脂多糖刺激大鼠肝組織后Src抑制的蛋白激酶C底物的表達(dá)變化.中華肝臟病雜志，2008，16：57-58.

8 孫林林，石軍，郝菁華，等.高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化模型的建立.臨床肝臟病學(xué)，2011，27：254-257，272.

Role of Qingzhi Hugan Prescription in nonalcoholic steatohepatitis of rats model

H E H ong-mei，Q U Li-hong，S H A O Jian-guo，C H E N Lin，LI Ming，Z H A N G Ling-yan，G U Chun-yan. N anjing University of Traditional Chinese M edicine，N anjing210046，China

S H A O Jian-guo，E m ail：shaojianguo4144@163.com

Objective To investigate the role and mechanism of Qingzhi H ugan Prescription in nonalcoholic steatohepatitis of rats m odel.M ethods In vivo experiment：Fifty-eight SD male rats except control group，all rats were treated with high-fat for 8 weeks and the m odels were established.The m odels were rando mized into m odel group，Qingzhi H ugan Prescription groups（large，mediu m and small dose）.The m odel and control group were gavaged with 0.9% NaCl solution.The Qingzhi H ugan Prescription groups were gavaged with decotions for 6 weeks.The m ouse changes in body weight and behaviors were recorded.The next day after the end of the intervention，all rats were sacrificed and the seru m and livers were obtained.The expression of H ck，Lyn，F(xiàn)gr and SSeC K S in the rat liver tissue were deceted by im m unohistochemistry.In vitro experiment：m odel group of K upffer cells after stim ulation with different concentrations at different times of C Cl4 were training with optimization of the Qingzhi H ugan Prescription medicatedseru m，the expression of H ck，Lyn，F(xiàn)gr and SSeC K S in kupffer cells were deceted by im m unocytochemistry.Results Co m pared with the control group，the m odel group weight was obviously increased（P＜0.05），A L T，A ST，T Bilin rats m odel group were higher than control group（P＜0.05）.Co m pared with normal control group，the T G，C H and L D L of m odel group were significantly increased（P＜0.01），and H D L was reduced （P＜ 0.05）.Co m pared with the m odel group，the T G，L D L of Qingzhi H ugan Prescription groups were reduced（P＜0.05），especially high dose group；The C H of each dose group of Qingzhi H ugan Prescription was decreased，but only the large dose group was statistically difference（P＜0.05）.The results of IC C showed that：Lyn，H ck were expressed in kupffer cells，and associ-ated with inflam mation was positively，after training with the Qingzhi H ugan Prescription medicated seru m，the expression were reduced.But the expression of Fgr and SSeC K S was not obvious in kupffer cells.The results of IH C indicated that：co m pared with m odel group，w hatever the large，mediu m and small dose of the Chinese medicine groups，especially the large dose of Qingzhi H ugan Prescription group，the positive expression of H ck and Lyn were decreased markedly（P＜0.01）；Co m pared with the normal group，the expression of SSeC K S in m odel group was decreased markedly；In the Chinese medicine groups，the SSeC K S were expressed between the m odel group and normal group；It showed a trend of decrease along with the rise of the expression of Lyn and H ck in the rat liver tissue with nonalcoholic fatty liver disease；Co m pared with m odel group，effect of Qingzhi H ugan Prescription on the expression of Fgr was insignificant（P＞0.05）. Conclusion Qingzhi H ugan Prescription especially the large dose group can efficiently im prove the inflam matory reaction in the rats m odel of nonalcoholic steatohepatitis，liver function，blood lipids index were im proved significantly，and the mechanism may be related with SSeC K S、Lyn and H ck signaling path ways.The higher the dose，the m ore significant the efficacy.

Qingzhi H ugan Prescription；Nonalcoholic steatohepatitis；Liver function；Blood lipids；SSeC K S、Lyn、H ck、Fgr

2015-01-23）

（本文編輯：錢燕）

江蘇省科技廳面上項(xiàng)目（B K2011394），南通市科技局社會發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（K11907）

210046 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（何紅梅，第一作者）；上海市同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院（屈莉紅，共同第一作者）；江蘇省南通市第三人民醫(yī)院（邵建國，陳琳，李民，顧春燕）；江蘇省南通市第六人民醫(yī)院（張玲燕）

邵建國，E mail：shaojianguo4144@163.co m