孫雙雙 傅青春 楊峻 程明亮 王曉今 倪鎏達(dá) 施莉琴 王琳 夏凡 陳成偉

隨著人們對(duì)藥物性肝損傷（DILI）的不斷認(rèn)識(shí)和新藥的不斷開發(fā)，DILI發(fā)生率明顯上升，但DILI無特異性的診斷標(biāo)志，藥物激發(fā)試驗(yàn)存在一定風(fēng)險(xiǎn)和倫理學(xué)問題。藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)是一種無創(chuàng)的體外診斷方法［1］。20世紀(jì)70年代，日本學(xué)者鑒于過敏特異質(zhì)性肝損傷，建立了藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)（DLST）并沿用至今。2004年的DDW－Japan會(huì)議上，日本肝病學(xué)會(huì)針對(duì)DILI診斷提出了新方案，在1993年Danan方案基礎(chǔ)上增加了DLST。40多年來DILI的檢測(cè)方法不斷趨于成熟，但由于缺乏多地區(qū)、可重復(fù)性數(shù)據(jù)，尚未被美國食品與藥品管理局（food and drugs administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)，陳高艷等［2］于2010年也建立了DLST方法并作了初步報(bào)道。本研究對(duì)診斷為DILI行DLST的患者進(jìn)行分析，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)DLST在DILI診斷中的意義。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收取2011年7月至2014年8月確診為DILI 84例，疑診DILI患者17例，非DILI患者17例（基礎(chǔ)肝臟疾病14例，肺結(jié)核2例，甲狀腺功能亢進(jìn)1例），72例健康人作為對(duì)照。檢測(cè)對(duì)象平均年齡51歲（15～89歲），男51例，女67例。DILI臨床診斷依據(jù)為排除其他病因引起的肝損傷，經(jīng)RUCAM評(píng)分并結(jié)合專家意見作出，部分患者取得肝組織證據(jù)。

二、方法

（一）提取PBMC細(xì)胞 新鮮全血5 mL，超凈臺(tái)中取5 mL淋巴細(xì)胞分離液Ficoll于15 mL無菌離心管內(nèi)，將3 mL抗凝血小心沿管壁緩緩加入其中，3 000 r/min，離心30 min，吸取PBMC層，將吸取的PBMC打入另一15 mL無菌離心管中，加入1×PBS 10 mL洗滌細(xì)胞，2000 r/min，10 min，棄上清液，用10%FCS－RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL［3］。

（二）細(xì)胞點(diǎn)板布局 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板設(shè)計(jì)點(diǎn)板布局。實(shí)驗(yàn)設(shè)健康對(duì)照組、陽性對(duì)照組和DILI組（可疑藥物按循環(huán)血量一次給藥量的血藥濃度計(jì)算），每組均設(shè)3復(fù)孔。健康對(duì)照組：100μL細(xì)胞懸液＋100μL細(xì)胞培養(yǎng)液；陽性對(duì)照組：100μL細(xì)胞懸液＋100μL PHA 稀釋液（終濃度10μg/mL）；DILI組：100μL細(xì)胞懸液＋100μL配置的藥物。將96孔板周邊孔加滿水，以防邊孔效應(yīng)，放入37°C、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（三）3H －TdR（thymidine）摻入 細(xì)胞培養(yǎng)52 h后每孔加入10μL3H－TDR繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，取出培養(yǎng)板，用多頭細(xì)胞收集儀收集各孔細(xì)胞于“9999”型玻璃濾紙；烘干后濾紙放入含1.5 mL閃爍液的液閃瓶中，于SN－6930型液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)CPM值。

（四）結(jié)果判斷 計(jì)算SI，SI＝（實(shí)驗(yàn)組均值－機(jī)器本底）/（對(duì)照組均值－機(jī)器本底），結(jié)果大于1.8為陽性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各指標(biāo)動(dòng)態(tài)曲線變化采用重復(fù)測(cè)量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、DLST的總體檢測(cè)結(jié)果

101例臨床診斷或疑診為DILI中 ，DLST陽性36例（35.6%），其中男15例，女21例；DLST陰性65例（65%），其中男33例，女32例。72例健康對(duì)照組中僅1例陽性，女性，27歲，作為對(duì)照投入藥物為中藥馬勃，其服藥史不詳。臨床診斷或疑診為DILI 101例患者中，DLST檢測(cè)的敏感度為35.6%，特異度為98.6%。敏感度可能還取決于所測(cè)試的藥物對(duì)淋巴細(xì)胞致敏的程度。DLST陽性組和陰性組相比，性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.667）。

二、DLST檢測(cè)與臨床分型

DLST陽性患者中肝細(xì)胞型16例（44.4%），混合型8例（22%），膽汁淤積型5例（13.8%），無法判斷7例（19.4%）。DLST 陰性患者中肝細(xì)胞型30例（46.1%），混合型18例（27.6%），膽汁淤積型6例（9.2%），特 殊 型 1 例 （15.3），無 法 判 斷 10 例（15.6%）。DLST在膽汁淤積型檢出率偏低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、DLST與臨床表現(xiàn)的關(guān)系

118例患者中臨床表現(xiàn)伴發(fā)熱16例，其中確診及疑診為DILI 15例（DLST陽性8例，DLST陰性7例），非DILI 1例；皮疹9例，其中確診及疑診為DILI 6例（DLST陽性3例，DLST陰性3例），非DILI 3例；關(guān)節(jié)酸痛8例，其中確診及疑診為DILI 6例（DLST陽性2例，DLST陰性4例），非DILI 2例；嗜酸粒細(xì)胞比例增高者20例，其中確診及疑診為DILI 18例（DLST陽性13例，DLST陰性3例），非DILI 4例；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.014），可見DLST與臨床表現(xiàn)具有一定關(guān)聯(lián)性。

四、DLST與RUCAM評(píng)分關(guān)系

按RUCAM量表診斷DILI，＞8分：非?？赡埽?～8分：很可能；3～5分：可能；1～2分：不象；≤0分：無關(guān)。DLST陽性RUCAM評(píng)分患者6分14例，7分12例，8分9例，9分1例，≤5分者DLST均為陰性。本組結(jié)果表明DLST陽性者集中在6～8分的很可能段。DLST與RUCAM評(píng)分結(jié)合，應(yīng)可以提高DILI診斷的準(zhǔn)確性。

五、DLST與抗結(jié)核藥引起的DILI

因服用抗結(jié)核藥診斷或疑診為DILI 35例，其中DLST陽性16例（45.7%）異煙肼、利福平、利福噴丁、吡嗪酰胺、鏈霉素。DLST陽性與藥物激發(fā)試驗(yàn)（drug provocation test，DPT）結(jié)果有6例是一致的（異煙肼、利福平、吡嗪酰胺各2例）完全與DPT結(jié)果相反的有3例，考慮個(gè)體差異，患者再次用藥產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，故需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

討 論

DLST作為DILI的體外無創(chuàng)的診斷方法，最早用于診斷藥物誘導(dǎo)的肺損傷及藥物性肝病。Morii等［4］用DLST來診斷雌二醇導(dǎo)致的肝損傷。文獻(xiàn)報(bào)道DLST敏感度各不相同［4－6］，本研究顯示 DLST 敏感度為36%。有報(bào)道指出使用自身血清比AB血清敏感性要高［7］，在本研究中，起初使用小牛血清，改用AB血清發(fā)現(xiàn)敏感度較前有所提高，尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證。

本研究表明，DLST與RUCAM評(píng)分有較好的相關(guān)性。通過體外試驗(yàn)，評(píng)估過敏特異質(zhì)性DILI患者肝損傷與目標(biāo)藥物之間的關(guān)系，可解決臨床可疑肝損藥物撤除和重新服用抉擇上的無所適從。在目前尚無特異性診斷方法之前，DLST仍不失為一種可以作為主要診斷依據(jù)的方法。

本實(shí)驗(yàn)尚有值得改進(jìn)的地方，如最早有人提出藥物溶解度可以影響DLST的結(jié)果，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，這一問題也趨解決［8－10］。DLST 的結(jié)果與 DLST檢測(cè)的時(shí)間具有一定的關(guān)聯(lián)性［8］，若在DILI發(fā)生1～2周內(nèi)檢測(cè)DLST為陰性，間隔2～3個(gè)月后再次檢測(cè)可能為陽性，其機(jī)制并不是很清楚，可能與T淋巴細(xì)胞增殖的時(shí)間有關(guān)［4、11］。因此，DLST對(duì)藥物誘導(dǎo)的肝損傷尚有診斷的價(jià)值，但需進(jìn)一步改良。

本試驗(yàn)成功建立了DLST。3H－TdR摻入法進(jìn)行DLST檢測(cè)的方法學(xué)較為穩(wěn)定，可作為一種協(xié)助過敏特異質(zhì)性DILI診斷的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。

1 Ikegame S，Wakamatsu K，F(xiàn)ujita M，Nakanishi Y，Kajiki A.A case of isoniazid－induced liver injury diagnosed by use of the DLST，and successful reintroduction of isoniazid for pleural tuberculosis.Journal of infection and chemotherapy：official journal of the Japan Society of Chemotherapy，2011，17：530－533.

2 陳高艷，陳成偉，等.藥物淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn)建立（3H－TdR）及其藥物性肝病診斷中的應(yīng)用.中華肝臟病雜志，2012，3：190－192.

3 渡辺 真彰.薬物性肝障害におけるリンパ球刺激の診斷的価値と診斷 指針の評(píng)価.肝臓，2001，42：448－453.

4 Morii K，Nishisaka M，Nakamura S，Oda T，Aoyama Y，Yamamoto T，et al. A case of synthetic oestrogen－induced autoimmune hepatitis with microvesicular steatosis.Journal of clinical pharmacy and therapeutics，2014，39：573－6.

5 Suzuki Y，Miwa S，Shirai M，Ohba H，Murakami M，F(xiàn)ujita K，et al.Drug lymphocyte stimulation test in the diagnosis of adverse reactions to antituberculosis drugs.Chest，2008，134：1027－1032.

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7 Miwa S，Suzuki Y，Shirai M，et al.Drug lymphocyte stimulation test is not useful for side effects of anti－tuberculosis drugs despite its timing.INT J TUBERC LUNG DIS，2012，16：1265－1269.

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9 Mikio SAITO，Motohiro YAGI，Katsuji UNO，et al.Comparative Study of the Usefulness of the Drug－Induced Lymphocyte Stimulation Test and the Leukocyte Migration Test in Drug Allergies.Biol.Pharm.Bull，2008，31：299－304.

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11 Pichler WJ，Tilch J，The lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity Allergy，2004，59：809－820.