梁 平，李喜英，陳 宏，何曉丹，薛強(qiáng)東，饒 娟

（東莞康華醫(yī)院皮膚科，廣東東莞 523080）

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期梅毒患者外周血細(xì)胞T淋巴細(xì)胞亞群

梁 平，李喜英，陳 宏，何曉丹，薛強(qiáng)東，饒 娟

（東莞康華醫(yī)院皮膚科，廣東東莞 523080）

目的通過檢測(cè)早期梅毒患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群，了解機(jī)體在梅毒早期感染時(shí)的細(xì)胞免疫狀況，以指導(dǎo)臨床治療。方法應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)59名志愿者外周血CD3＋、CD4＋、CD8＋淋巴細(xì)胞亞群，其中健康對(duì)照組20例，一期梅毒（PS）組10例，二期梅毒（SS）組15例，早期潛伏梅毒（ELS）組14例。結(jié)果早期梅毒各組CD3＋、CD4＋、CD8＋均高于對(duì)照組，CD3＋是SS組最高，PS組次之，ELS組第3，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SS組高于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD4＋為ELS組最高，SS組次之，PS組第3，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD8＋為PS組最高，SS組次之，ELS組第3，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD4＋/CD8＋差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論早期梅毒細(xì)胞免疫有增強(qiáng)，這對(duì)清除TP是非常有利的。

梅毒； 外周血； 細(xì)胞免疫

2003年以來，梅毒蔓延態(tài)勢(shì)迅速，在我國(guó)以年均14.3%的比例增加［1］，早期梅毒（一期、二期和早期潛伏）傳染性強(qiáng)，是最重要的傳染源，也是目前防控的重點(diǎn)人群。梅毒螺旋體（TP）的感染初期表現(xiàn)為在入侵部位出現(xiàn)軟骨樣潰瘍面，稱為硬下疳，這是一期梅毒的典型臨床表現(xiàn)。未經(jīng)治療一期梅毒的潰瘍可“自愈”，但大多數(shù)未經(jīng)治療患者于硬下疳“自愈”6～8周后，會(huì)在生殖器周圍出現(xiàn)扁平濕疣和/或出現(xiàn)四肢、軀干等部位的銅紅色斑丘疹，這是二期梅毒的表現(xiàn)，二期梅毒未經(jīng)治療也可“自愈”，其中30%～40%的患者發(fā)展為三期梅毒，表現(xiàn)為心血管和神經(jīng)系統(tǒng)損害。在這個(gè)過程中還可有潛伏梅毒，并且潛伏可以發(fā)生在上述過程中的任何階段，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能與病原體的相互作用在疾病的發(fā)展和結(jié)局中起到了關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在接受青霉素的治療者中有35.71%以上失敗，免疫學(xué)治療成為提高療效的新方向，體液免疫在梅毒中對(duì)TP的應(yīng)答并不重要，細(xì)胞免疫在抗TP中起重要作用。為了解梅毒早期感染時(shí)的細(xì)胞免疫狀況，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)梅毒患者進(jìn)行外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，并與健康人群對(duì)照，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共收入在本院門診就診、體檢或術(shù)前檢查的志愿者59名，男38例，女21例，平均（31.9±10.8）歲。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 梅毒組:根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和血清學(xué)檢查綜合診斷的梅毒患者，知情同意，愿意加入本研究中，人免疫缺陷病毒（HIV）抗體陰性并且未使用過激素和抗菌藥物等藥物，無嚴(yán)重系統(tǒng)疾患。健康對(duì)照組:螺旋體抗原血清試驗(yàn)陰性、非螺旋體抗原血清試驗(yàn)和HIV抗體檢測(cè)均為陰性，無嚴(yán)重系統(tǒng)疾患，自愿加入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn):患有系統(tǒng)性疾、不愿加入本研究，螺旋體試驗(yàn)或非螺旋體試驗(yàn)有1項(xiàng)為陰性者。

1.3 方法 FACS Calibur流式細(xì)胞儀、淋巴細(xì)胞亞群試劑盒、紅細(xì)胞裂解液和破膜劑等儀器設(shè)備和試劑是由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。非螺旋體抗原血清試驗(yàn)所用的是上海榮盛生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）試劑盒；螺旋體抗原血清試驗(yàn)所用的是日本富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)的TP明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）試劑盒，HIV抗體試劑盒是由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供。上述各項(xiàng)試驗(yàn)的操作分別參照各種儀器及試劑說明書，按規(guī)程由專人負(fù)責(zé)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用STATA 8.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多間組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

對(duì)照組20例，男16例，女4例，平均（29.6±6.7）歲，TPPA、TRUST和HIV抗體均為陰性。梅毒組中，一期梅毒（PS組）10例，男6例，女4例，平均（35.0±9.7）歲，其中TPPA陰性2例，TPPA陽(yáng)性患者滴度1∶320～1∶10 240，中位數(shù)1∶2 560，TRUST陰性1例，TRUST陽(yáng)性患者的滴度1∶8～1∶64，中位數(shù)1∶16，HIV抗體均為陰性；二期梅毒（SS組）15例，男10例，女5例，平均（30.3±9.8）歲，TPPA均為陽(yáng)性，滴度1∶1 280～1∶10 240，中位數(shù)1∶2 560，TRUST滴度1∶2～1∶128，中位數(shù)1∶32，HIV抗體均為陰性；早期潛伏梅毒（ELS組）14例，男6例，女8例，平均（34.6±16.1）歲，TPPA均為陽(yáng)性，滴度1∶1 280～1∶10 240，中位數(shù)1∶2 560，TRUST滴度1∶4～1∶64，中位數(shù)1∶32，HIV抗體均為陰性。對(duì)照組與梅毒各亞組間性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

梅毒各亞組CD3＋、CD4＋、CD8＋均高于對(duì)照組，CD3＋是SS組最高，PS組次，ELS組第3，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較SS組高于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD4＋為ELS組最高，SS組次，PS組第3，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD8＋為PS組最高，SS組次，ELS組第3，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD4＋/CD8＋在對(duì)照組中最大值為1.92，最小值為0.51；PS組中最大值為3.02，最小值為0.33；SS組中最大值為1.74，最小值為0.51；ELS組中最大值為3.20，最小值為0.84，兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

3 討 論

本研究中發(fā)現(xiàn)PS組有1例TPPA和TRUST均為陰性的患者，但通過病史、臨床表現(xiàn)和隨訪TPPA和TRUST轉(zhuǎn)陽(yáng)的結(jié)果，確診為PS；并發(fā)現(xiàn)另外1例患者TRUST為陽(yáng)性、TPPA為陰性，也是通過病史、臨床表現(xiàn)和隨訪TPPA和TRUST的結(jié)果，確診為PS，可見TRUST轉(zhuǎn)為陽(yáng)性先于TPPA。對(duì)于PS的診斷，不能單純依靠血清學(xué)，病史、臨床表現(xiàn)及隨訪是很重要的。

T細(xì)胞以CD3＋作為表面標(biāo)記，反映細(xì)胞免疫功能狀況，按生物學(xué)功能分為不同的亞群，各亞群相互作用但又各有其功能，共同完成免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)作用。在與顆粒性抗原接觸時(shí)產(chǎn)生免疫作用，T淋巴細(xì)胞既可作為免疫效應(yīng)細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞，又可作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，輔助其他免疫細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。T細(xì)胞按表型的不同可分為占外周血總淋巴細(xì)胞35%～50%的CD4＋細(xì)胞和占外周血總淋巴細(xì)胞24%～30%的CD8＋細(xì)胞兩個(gè)細(xì)胞亞群，分別代表功能不同的兩個(gè)群體。

CD4＋細(xì)胞主要是輔助性T淋巴細(xì)胞（Th），又可以分為Th1和Th2兩個(gè)亞群，TP感染刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞活化形成Th0細(xì)胞，并進(jìn)而向Th1方向極化，Th1分泌白細(xì)胞介素－2 （IL－2）和γ－干擾素（IFN－γ）等細(xì)胞因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞抑制和殺傷TP，并可抑制Th2的功能，增強(qiáng)細(xì)胞免疫。早期梅毒清除機(jī)制的關(guān)鍵是遲發(fā)性超敏反應(yīng)巨噬細(xì)胞的活化，活化的Th1細(xì)胞分泌IL－2、IFN－γ等細(xì)胞因子上調(diào)巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，參與反應(yīng)的巨噬細(xì)胞不僅起到呑噬細(xì)胞的作用，又能起到抗原提呈細(xì)胞的作用，上調(diào)T細(xì)胞的功能，在機(jī)體抗TP感染的過程中發(fā)揮著重要作用［2－3］。Th2分泌白細(xì)胞介素－4（IL－4）和白細(xì)胞介素－10（IL－10）等細(xì)胞因子，與B淋巴細(xì)胞增殖、成熟和促進(jìn)抗體生成有關(guān)，可增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并可下調(diào)Th1對(duì)TP的免疫應(yīng)答。

CD8＋細(xì)胞主要介導(dǎo)一些抗病毒和抗真菌感染的細(xì)胞免疫反應(yīng)，抗螺旋體感染的免疫功能可介導(dǎo)TP的清除，但主要是抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，在抑制自身反應(yīng)性CD4＋細(xì)胞活性的同時(shí)，也可抑制TP制動(dòng)抗體的產(chǎn)生，降低機(jī)體抵抗和清除TP感染的能力，造成TP的繁殖、擴(kuò)散和梅毒的潛伏。CD8＋細(xì)胞可以分為在數(shù)量上占多數(shù)的抑制性T淋巴細(xì)胞（Ts）和占少數(shù)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）兩個(gè)亞群，Ts細(xì)胞通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、IL－10等細(xì)胞因子抑制Th1對(duì)TP的免疫應(yīng)答，Ts增高表明細(xì)胞免疫功能受到抑制，CTL通過細(xì)胞裂解和細(xì)胞凋亡作用介導(dǎo)殺傷TP，而CTL增高則對(duì)清除TP有增強(qiáng)作用。

本研究結(jié)果表明早期梅毒CD3＋和CD4＋均高于對(duì)照，雖然最終只是發(fā)現(xiàn)SS組CD3＋高于對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能還在于樣本量的不足，有待今后進(jìn)一步增大樣本量，但已經(jīng)初步表明早期梅毒細(xì)胞免疫有增強(qiáng)，這對(duì)清除TP是非常有利的。

CD4＋/CD8＋綜合了CD4＋和CD8＋兩者的信息，比單獨(dú)CD4＋或CD8＋的結(jié)果更能反映機(jī)體免疫狀況。大多數(shù)感染性疾病發(fā)生時(shí)CD4＋/CD8＋下降，但該比值的下降只能表明存在T細(xì)胞免疫功能紊亂，還需要進(jìn)一步檢查，動(dòng)態(tài)觀察其變化更有意義。本研究中CD4＋/CD8＋最大值在ELS組，最小值在PS組，統(tǒng)計(jì)學(xué)無異常發(fā)現(xiàn)，早期梅毒感染者細(xì)胞免疫功能屬正常范圍。由于研究結(jié)果采用的是均數(shù)，不能很好地反映動(dòng)態(tài)變化，如能根據(jù)感染后時(shí)間進(jìn)行相應(yīng)測(cè)定，可能更有利于免疫學(xué)改變的解釋，這種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肯定是非常有幫助的。

細(xì)胞水平上的認(rèn)識(shí)是有差異的，有學(xué)者認(rèn)為梅毒感染者細(xì)胞免疫受抑制，從而認(rèn)為臨床治療梅毒時(shí)加用免疫調(diào)節(jié)劑可以增強(qiáng)療效［4－5］，盡管目前關(guān)于免疫調(diào)節(jié)治療對(duì)梅毒的療效有肯定的一面，但這種應(yīng)用的結(jié)果還有待進(jìn)一步證實(shí)。

事實(shí)上在梅毒感染過程中CD4＋、CD8＋和CD4＋/CD8＋既可以升高也可以下降，這應(yīng)是人體免疫對(duì)TP應(yīng)答的正確表述，即便在HIV感染早期，CD4＋也升高，只在疾病的發(fā)展過程中CD4＋的破壞超過合成才出現(xiàn)CD4＋和CD4＋/CD8＋比值的下降。

本研究沒有進(jìn)行Th1及Th2亞群及其淋巴因子分子水平的檢測(cè)，這是基于一期梅毒向二期梅毒的發(fā)展過程中始終是Th1優(yōu)勢(shì)這一結(jié)論。Fitzgerald［6］綜合多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，推測(cè)在人體一期梅毒向二期梅毒的發(fā)展過程中CD4＋亞群從Th1占優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)變?yōu)門h2占優(yōu)勢(shì)的漂移學(xué)說，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)有充足的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的幾乎完全相矛盾的兩種結(jié)果，即人體在TP感染時(shí)外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)既有升高也有降低。盡管目前仍有學(xué)者非常推崇Th1/Th2漂移學(xué)說，在較早期的研究中，Van等［7］和Wicher等［8］就完全否認(rèn)一期梅毒向二期梅毒的發(fā)展過程中有Th1亞群向Th2亞群漂移，并認(rèn)為在一期梅毒向二期梅毒的發(fā)展過程中始終是Th1優(yōu)勢(shì)，只有如此才能達(dá)到早期梅毒患者的皮疹自行消退和無癥狀潛伏，近期Leader等［9］和李軍等［10］研究再次證實(shí)與早期研究結(jié)果相一致。

外周血中CD4＋的降低和CD8＋的升高與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)［11］，CD4＋和CD4＋/CD8＋在潛伏梅毒時(shí)升高，在一期梅毒向二期梅毒和三期神經(jīng)梅毒的發(fā)展過程中，CD4＋逐步下降而CD8＋逐步升高，但CD4＋始終高于CD8＋，只是在惡性梅毒和嚴(yán)重的神經(jīng)梅毒時(shí)，CD4＋明顯下降、CD8＋升高才表現(xiàn)出CD4＋/CD8＋明顯降低。梁平等［12］在觀察一期梅毒患者的研究中表明在硬下疳潰瘍的第一周細(xì)胞免疫功能受抑制，第二周時(shí)增強(qiáng)。孫莉等［13］研究發(fā)現(xiàn)隨血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR）滴度增高，CD8＋細(xì)胞數(shù)量升高、CD4＋/CD8＋比值降低。

目前梅毒的免疫學(xué)研究不僅是外周血或組織中CD4＋、CD8＋等細(xì)胞和Th1、Th2亞群及其細(xì)胞因子的水平，而是已經(jīng)到了腦脊液的Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的層面上［14－15］，這是下一步研究的著眼點(diǎn)?？傊范靖腥緯r(shí)機(jī)體的細(xì)胞免疫可能既有抑制也有增強(qiáng)，不能一味地強(qiáng)調(diào)梅毒感染者就是免疫抑制，畢竟早期梅毒不經(jīng)治療只有30%～40%的患者發(fā)展為三期梅毒，也就是說大部分患者的確是自愈了，免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步觀察。

［1］胡冰雪，曲波，劉潔，等.中國(guó)1990～2011年梅毒流行特征分析與趨勢(shì)預(yù)測(cè)［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014，41（6）:961－963.

［2］Podwinska J，Lusiak M，Zaba R，et al.The pattern and level of cytokines secreted by Th1 and Th2 lymphocytes of syphilitic patients correlate to the progression of the disease［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2000，28（1）:1－14.

［3］Salazar JC，Hazlett KR，Radolf JD.The immune response to infection with Treponema pallidum，the stealth pathogen［J］.Microbes Infect，2002，4（11）:1133－1140.

［4］劉金花，楊日東，吳志華.免疫增強(qiáng)治療對(duì)隱性梅毒患者Th1/Th2細(xì)胞因子的影響［J］.皮膚病與性病，2013，35（5）:257－259.

［5］易恒安.免疫增強(qiáng)治療對(duì)二期梅毒預(yù)后影響的研究［J］.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34（1）:151－152.

［6］Fitzgerald TJ.The Th1/Th2－like switch in syphilitic infection:is it detrimental［J］.Infect Immun，1992，60（9）:3475－3479.

［7］Van Voorhis WC，Barrett LK，Koelle DM，et al.Primary and secondary syphilis lesions contain mRNA for Th1 cytokines［J］.J Infect Dis，1996，173（2）:491－495.

［8］Wicher V，Zhao J，Dilwith R，et al.Immune abnormalities in guinea pigs with asymptomatic congenital syphilis［J］.Pediatr Res，1997，42（6）:794－798.

［9］Leader BT，Godornes C，Van Voorhis WC，et al.CD4＋lymphocytes and gamma interferon predominate in local immune responses in early experimental syphilis［J］.Infect Immun，2007，75（6）: 3021－3026.

［10］李軍，王林娜，鄭和義.二期梅毒患者外周血白細(xì)胞介素－2水平［J］.協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志，2012，03（4）:395－397.

［11］Podwinska J，Zaba R，Chomik M，et al.The ability of peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of syphilitic patients to produce IL－2［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，1995，12（1）:17－27.

［12］梁平，陳宏，何曉丹，等.流式細(xì)胞術(shù)分析一期梅毒外周血T淋巴細(xì)胞亞群［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2013，8（9）:8－9.

［13］孫莉，王翠玉，李娟.梅毒患者T細(xì)胞亞群測(cè)定及臨床意義［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30（2）:271－272.

［14］Li K，Wang C，Lu H，et al.Regulatory T cells in peripheral blood and cerebrospinal fluid of syphilis patients with and without neurological involvement［J］.PLoS Negl Trop Dis，2013，7（11）:2528－2531.

［15］Wang C，Zhu L，Gao Z，et al.Increased interleukin－17 in peripheral blood and cerebrospinal fluid of neurosyphilis patients［J］.PLoS Negl Trop Dis，2014，8（7）:3004－3009.

Flow cytometric detection of peripheral blood T lymphocyte subpopulations in patients with early syphilis

Liang Ping，Li Xiying，Chen Hong，He Xiaodan，Xue Qiangdong，Rao Juan
（Department of Dermatology and Venereology，Dongguan Kanghua Hospital，Dongguan，Guangdong 523080，China）

ObjectiveTo detect the lymphocyte subpopulations in patients with early syphilis，so as to know their immunity condition and guide clinical treatment.MethodsFlow cytometry was used to detect CD3＋，CD4＋and CD8＋lymphocyte subpopulations in peripheral blood from 59 volunteers，including 20 normal individuals（Cont group），10 patients with primary syphilis（PS group），15 patients with secondary syphilis（SS group）and 14 patients with early latent syphilis（ELS group）.ResultsCD3＋，CD4＋and CD8＋lymphocyte subpopulations in each syphilis groups were higher than Cont group.SS group had the highest CD3＋level，second was PS group，and third was ELS group.There was significant difference among three groups（P＜0.05）.The CD3＋level of SS group was significantly higher than that of Cont group（P＜0.05）.ELS group had the highest CD4＋level，second was SS group，third was PS group.The difference of CD4＋level was significant among three groups（P＜0.05）.PS group had the highest CD8＋level，second was SS group，third was ELS group.However，the difference of CD8＋level among three groups was not significant（P＞0.05）.There was no significant difference of CD4＋/CD8＋among three groups（P＞0.05）.ConclusionCytoimmunity in early syphilis enhances，which could be benefit to eliminate Treponema Pallidum.

syphilis； peripheral blood； cytoimmunity

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.033

A

1673－4130（2015）10－1395－03

2015－01－15）

梁平，男，副主任醫(yī)師，主要從事梅毒臨床和相關(guān)基礎(chǔ)研究。