王小林，李 昂，楊 碩

（北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191）

流式細(xì)胞儀性能評(píng)價(jià)方法的建立

王小林，李 昂，楊 碩

（北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191）

目的建立流式細(xì)胞儀性能評(píng)價(jià)方法。方法基于《YY/T0588－2005流式細(xì)胞儀》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，利用BriCyte E6流式細(xì)胞儀，建立適用于流式細(xì)胞儀性能評(píng)價(jià)的測(cè)試方案，包括熒光靈敏度、熒光線性、前向角散射光檢測(cè)靈敏度、儀器分辨率、前向角散射光和側(cè)向角散射光分辨率、倍體分析線性、攜帶污染率、表面標(biāo)志物檢測(cè)準(zhǔn)確性、表面標(biāo)志物檢測(cè)重復(fù)性、儀器穩(wěn)定性等。結(jié)果該流式細(xì)胞儀各項(xiàng)性能指標(biāo)均滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的技術(shù)要求。結(jié)論上述性能指標(biāo)測(cè)試方法可靠，能夠?qū)α魇郊?xì)胞儀性能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。該方法對(duì)于流式細(xì)胞儀性能驗(yàn)證有一定的指導(dǎo)意義。

流式細(xì)胞儀； 性能評(píng)價(jià)； BriCyte E6

流式細(xì)胞儀主要用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域，以及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是在獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）和腫瘤患者淋巴細(xì)胞免疫功能評(píng)價(jià)、白血病免疫分型及微量殘留病診斷方面，具有不可替代的作用［1－2］。本研究以《YY/T0588－2005流式細(xì)胞儀》為依據(jù)，建立了流式細(xì)胞儀性能評(píng)價(jià)方案，旨在為流式細(xì)胞儀整體性能評(píng)價(jià)提供詳細(xì)、完整的測(cè)試方案。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 邁瑞公司BriCyte E6流式細(xì)胞儀及配套CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色試劑和溶血?jiǎng)?；Duke公司Duke Standards（3K1000）、Duke Standards（4K－03）標(biāo)準(zhǔn)微球；Spherotech公司Rainbow calibration particles （RCP－30－2）、Rainbow calibration particles（RCP－30－5A）標(biāo)準(zhǔn)微球；BD公司DNA QC Particles標(biāo)準(zhǔn)微球；R＆D公司Status－Flow?Flow Cytometry Control質(zhì)控品。

1.2 方法

1.2.1 熒光靈敏度 取適量RCP－30－5A標(biāo)準(zhǔn)微球，用1 mL鞘液稀釋混勻后上機(jī)檢測(cè)，獲取各個(gè)峰的平均熒光強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)微球說明書提供的各個(gè)峰的等量可溶性熒光分子數(shù)（MESF），按照隨試劑附帶的標(biāo)準(zhǔn)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。技術(shù)要求:FITC不大于200 MESF，PE不大于100 MESF。

1.2.2 熒光線性 取適量RCP－30－5A標(biāo)準(zhǔn)微球，用1 m L鞘液稀釋混勻后上機(jī)檢測(cè)，得到各個(gè)峰的平均熒光強(qiáng)度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)微球說明書提供的各個(gè)峰的MESF，以MESF（Y）和平均熒光強(qiáng)度（X）的線性回歸方程，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)（r）。技術(shù)要求:r≥0.98。

1.2.3 前向角散射光（FSC）檢測(cè)靈敏度 取1μm 3K1000標(biāo)準(zhǔn)微球，加入裝有1 mL鞘液的試管中，充分混勻后上機(jī)檢測(cè)，檢查直方圖上顯示的峰值信號(hào)及顯示峰值信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)微球直徑。技術(shù)要求:FSC檢測(cè)靈敏度應(yīng)不大于1μm。

1.2.4 儀器分辨率 將RCP－30－2標(biāo)準(zhǔn)微球稀釋于1 m L磷酸鹽緩沖液（PBS）中，混勻后上機(jī)測(cè)試，獲取FSC和FL1～6各熒光通道的變異系數(shù)（CV）。技術(shù)要求:FSC通道CV≤2.0%；FITC、PE通道CV≤2.0%；PerCP、PE－Cy7、APC、APCCy7通道CV≤4.0%。

1.2.5 FSC和側(cè)向角散射光（SSC）分辨率 （1）取5μL枸櫞酸鈉抗凝外周血，加入裝有1 m L鞘液的試管中，混勻后上機(jī)檢測(cè)。技術(shù)要求:FSC/SSC圖應(yīng)能將外周血中的血小板和紅細(xì)胞分開。（2）取100μL乙二胺四乙酸抗凝外周血，溶血處理后上機(jī)檢測(cè)。技術(shù)要求:FSC/SSC圖應(yīng)能將外周血的白細(xì)胞三群（淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞）分開。

1.2.6 倍體分析線性 DNA QC Particles中的小雞紅細(xì)胞核（CEN）或小牛胸腺細(xì)胞核（CTN）經(jīng)過碘化丙啶（PI）染色后上機(jī)檢測(cè)，獲取G2/M期（四倍體細(xì)胞峰）與G0/G1期（二倍體細(xì)胞峰）平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算二者比值。技術(shù)要求:比值范圍1.95～2.05。

1.2.7 攜帶污染率 取適量4K－03標(biāo)準(zhǔn)微球，用1 m L鞘液稀釋混勻后連續(xù)上機(jī)測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為H1～1、H1～2、H1～3。進(jìn)行一次標(biāo)本管返沖循環(huán)后，再進(jìn)行空白數(shù)量測(cè)試，連續(xù)測(cè)試3次，計(jì)算標(biāo)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別為L(zhǎng)1～1、L1～2、L1～3。按照此程序循環(huán)3次，再計(jì)算攜帶污染率值Ci），取最大值。

式中:Ci為第i次循環(huán)的攜帶污染率，i＝1～3。技術(shù)要求:攜帶污染率不大于1%。

1.2.8 表面標(biāo)志物檢測(cè)的準(zhǔn)確性 使用CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色試劑對(duì)StatusFlow?Flow Cytometry Control質(zhì)控品進(jìn)行CD3、CD4、CD8標(biāo)記，重復(fù)5次，測(cè)定CD3、CD4、CD8陽(yáng)性百分比，分別計(jì)算平均值。技術(shù)要求:結(jié)果應(yīng)在質(zhì)控品說明書給定的參考范圍內(nèi)。

1.2.9 表面標(biāo)志物檢測(cè)的重復(fù)性 使用CD3－FITC/CD8－PE/CD45－PerCP/CD4－APC四色試劑對(duì)StatusFlow?Flow Cytometry Control質(zhì)控品進(jìn)行CD3、CD4、CD8標(biāo)記，重復(fù)測(cè)定20次，分別計(jì)算CD3、CD4和CD8陽(yáng)性百分比結(jié)果的CV。技術(shù)要求:CV≤10%。

1.2.10 儀器穩(wěn)定性 環(huán)境溫度變化不超過設(shè)定溫度的5%時(shí)，取適量RCP－30－2加入裝有1 m L PBS的試管中，充分混勻后上機(jī)檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)微球平均熒光強(qiáng)度（FL1）。連續(xù)開機(jī)8 h后，在流式細(xì)胞儀的相同設(shè)置條件下重復(fù)前述步驟，得到標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度（FL2）。按公式計(jì)算FL1、FL2偏差值（B）。

技術(shù)要求:在8 h內(nèi)檢測(cè)FSC及所有熒光通道峰值平均熒光強(qiáng)度偏差值不超過±10%。

2 結(jié) 果

2.1 熒光靈敏度和熒光線性 FITC通道熒光靈敏度為48 MESF，PE通道熒光靈敏度為50 MESF，二者的r分別為0.997 8、0.997 2，滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.2 FSC檢測(cè)靈敏度 FSC檢測(cè)靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖1，直方圖上顯示直徑為1μm微球的信號(hào)峰，滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.3 分辨率 FSC及各熒光通道（FL1～6）的CV分別為1.2%、1.0%、1.5%、2.0%、2.6%、3.2%、2.4%，均滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.4 FSC和SSC分辨率 FSC和SSC散點(diǎn)圖可將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞分開，也能將血小板和紅細(xì)胞分開，滿足規(guī)定的技術(shù)要求，見圖2。

2.5 倍體分析線性 G2/M期和G0/G1期平均熒光強(qiáng)度分別為527 383.1、266 246.7，比值為1.98，滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.6 攜帶污染率 3次檢測(cè)的攜帶污染率分別為0.02%、0.04%、0.03%，滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.7 表面標(biāo)志物檢測(cè)準(zhǔn)確性 質(zhì)控品CD3、CD4、CD8陽(yáng)性百分比的平均值均在說明書給定的參考范圍內(nèi)，滿足規(guī)定的技術(shù)要求，見表1。

2.8 表面標(biāo)志物檢測(cè)的重復(fù)性 質(zhì)控品CD3、CD4、CD8陽(yáng)性百分比結(jié)果的CV分別為0.83%、1.31%、2.40%，滿足規(guī)定的技術(shù)要求。

2.9 儀器穩(wěn)定性 0 h和8 h檢測(cè)了FSC及FL1～6熒光通道平均熒光強(qiáng)度，偏差值均滿足規(guī)定的技術(shù)要求，見表2。

3 討 論

關(guān)于流式細(xì)胞儀性能的評(píng)價(jià)，國(guó)際上還沒有公認(rèn)的方法和要求。對(duì)于科研領(lǐng)域而言，一般通過考察重復(fù)性和熒光靈敏度等指標(biāo)，即可對(duì)儀器性能做出初步評(píng)價(jià)［1，3－5］，但對(duì)于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域來說，僅僅考察重復(fù)性和熒光靈敏度是不夠的。流式細(xì)胞儀輸出的檢測(cè)結(jié)果會(huì)被用于疾病診治、預(yù)后判斷等。因此，除了重復(fù)性和熒光靈敏度外，更關(guān)注于可能影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的性能指標(biāo)。為此，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2005年發(fā)布了醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T0588－2005流式細(xì)胞儀》，對(duì)流式細(xì)胞儀的評(píng)價(jià)項(xiàng)目不僅涵蓋了重復(fù)性、熒光靈敏度等基本性能，而且增加了表面標(biāo)志物準(zhǔn)確性、表面標(biāo)志物重復(fù)性、攜帶污染率等臨床醫(yī)生更為關(guān)注的性能指標(biāo)，并對(duì)各項(xiàng)性能指標(biāo)的技術(shù)要求等做了明確的定義［3］。

盡管《YY/T0588－2005流式細(xì)胞儀》已經(jīng)發(fā)布多年，但該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于儀器分辨率的具體計(jì)算方法、對(duì)各熒光通道分辨率的技術(shù)要求，以及各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的具體操作步驟描述得不夠詳盡，使得該標(biāo)準(zhǔn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中未能得到廣泛應(yīng)用。為此，本次評(píng)價(jià)對(duì)分辨率的具體計(jì)算方法和對(duì)各通道分辨率的技術(shù)要求做了細(xì)化，對(duì)評(píng)價(jià)的具體操作過程也做了說明，為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)流式細(xì)胞儀的性能提供了一套詳盡的參考方法。

［1］Sack U，Tarnok A.Cellular diagnostics:Basic principles，methods and clinical applications of flow cytometry［M］.Basel:Karger， 2009.

［2］劉艷榮.實(shí)用流式細(xì)胞術(shù)－血液病篇［M］.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010.

［3］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.YY/T0588－2005流式細(xì)胞儀［S］.北京:國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，2005.

［4］Hoffman R.Standardization，calibration，and control in flow cytometry［M］.NJ，USA:John Wiley ＆Sons，2012.

［5］Shapiro HM.Practical flow cytometry［M］.4th ed.NJ，USA:John Wiley ＆Sons，2003.

Establishment of evaluation methods for the performance of flow cytometer

Wang Xiaolin，Li Ang，Yang Shuo
（Department of Laboratory Medicine，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China）

ObjectiveTo Establish evaluation methods for the performance of flow cytometer.MethodsReferring to the industry standard YY/T0588－2005 Flow Cytometry，evaluating methods for the performance of BriCyte E6 flow cytometry was established，such as fluorescence sensitivity，fluorescence linearity，forward scatter sensitivity，instrument resolution，forward scatter/side scattering resolution，DNA content linearity，carry－over rate，accuracy of the cell surface marker，reproducibility of the cell surface marker and instrument stability.ResultsThe performance of BriCyte E6 met the requirements of industry standard.ConclusionThe evaluation methods for the performance parameters could be reliable and could be used for the performance evaluation of flow cytometer.

flow cytometry； performance evaluation； BriCyte E6

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.10.020

A

1673－4130（2015）10－1366－03

2015－01－07）

王小林，男，副主任技師，主要從事臨床血液及體液檢驗(yàn)研究。