蘇曉華，宋殿榮

·綜述·

普通婦科疾病及相關(guān)研究子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型研究進(jìn)展

蘇曉華，宋殿榮△

子宮內(nèi)膜異位癥是婦科常見病，是育齡期婦女盆腔痛和不孕的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療手段不充分，體內(nèi)、外模型的建立及應(yīng)用是探索子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展以及治療措施的重要途徑。通過手術(shù)建立子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型的方法主要包括同種移植和異種移植，同種移植是將同基因動(dòng)物的子宮內(nèi)膜組織移植到靈長類或嚙齒類動(dòng)物的腹腔，異種移植是將人體在位或異位子宮內(nèi)膜組織移植到免疫缺陷鼠體內(nèi)或直接種植到雞胚絨毛尿囊膜。本文分析、總結(jié)了子宮內(nèi)膜異位癥常用模型中靈長類、嚙齒類和雞胚絨毛尿囊膜不同動(dòng)物模型的構(gòu)建方法和優(yōu)缺點(diǎn)，旨在為實(shí)驗(yàn)中模型的選擇應(yīng)用提供指導(dǎo)。

子宮內(nèi)膜異位癥；疾病模型，動(dòng)物；靈長目；嚙齒；雞胚絨毛尿囊膜

【Abstract】Endometriosis is a common disease in gynecology，and it is one of the main reason that cause pelvic pain and infertility of women in childbearing age.The pathogenesis of endometriosis is unclear and the treatment is inadequate.The establishment and application of models in vivo and in vitro is an important way to explore the occurrence，development and treatment measures of endometriosis.Surgical methods of establishing animal models of endometriosis mainly included homograft and heterograft.Homologous model was established by transplanting uterine fragments into the peritoneal cavity of syngeneic non-human primates and rodents.Heterologous model was established by engrafting human eutopic or ectopic endometrial tissues into the immunodeficient mice or the chicken chorioallantoic membrane（CAM）.This article summarizes the construction methods of commonly used models of endometriosis including non-human primates model，rodents model and CAM model，and analyzes the advantages and disadvantages of them to provide a guidance for selection and application of models in experiments.

【Keywords】Endometriosis；Disease models，animal；Primates；Rodentia；Chicken chorioallantoic membrane

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：25-28）

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）是導(dǎo)致女性精神心理健康障礙和社會功能下降［1］的婦科常見病，其雖為良性疾病，卻具有無限生長、生成新生血管、浸潤并破壞周圍組織和局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的一些特性。目前對EMs的認(rèn)識雖已有100多年歷史，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，缺乏有效的早期診斷及治療方法，探討EMs的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，研究發(fā)病機(jī)制以及尋求新的、有效的診斷、治療方法都需要建立合理的動(dòng)物模型。目前研究EMs常用的動(dòng)物模型包括靈長類動(dòng)物模型、嚙齒類動(dòng)物模型和雞胚絨毛尿囊膜（CAM）模型。

1　靈長類動(dòng)物模型

靈長類動(dòng)物物種起源與人類接近，生殖解剖、生理學(xué)、基因和蛋白表達(dá)與人類相似，有規(guī)律的月經(jīng)周期及經(jīng)血逆流現(xiàn)象，可自發(fā)形成EMs，病灶病理學(xué)與人類相同，是理想的動(dòng)物模型。靈長類動(dòng)物模型主要包括自發(fā)性模型和人工誘導(dǎo)模型兩種。

1.1自發(fā)性模型1975年MacKenzie等［2］尸檢1只因結(jié)腸梗阻死亡的獼猴時(shí)發(fā)現(xiàn)，盆腔內(nèi)有大量充滿灰色或巧克力色液體的囊腫，病理證實(shí)病灶為子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)。1991年D′Hooghe等［3］用腹腔鏡檢查證實(shí)育齡期狒狒可自發(fā)形成盆腔EMs，發(fā)病部位多在卵巢、子宮韌帶、子宮漿膜層和腹膜表面，病理證實(shí)組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征與人類完全相同。自發(fā)性模型是選取有規(guī)律月經(jīng)周期及生育能力的雌性動(dòng)物，經(jīng)腹腔鏡檢查證實(shí)無EMs者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，正常飼養(yǎng)，定期剖腹或腹腔鏡檢查。自發(fā)性模型發(fā)病機(jī)制與人類相似，是最理想的動(dòng)物模型，但病灶形成緩慢，發(fā)病率低，發(fā)病周期長，需經(jīng)過多年建立模型，短期內(nèi)難以獲得大量的信息。

1.2人工誘導(dǎo)模型人工誘導(dǎo)模型包括提高EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和手術(shù)誘導(dǎo)兩種。提高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的主要方法是增加經(jīng)血逆流，1953年Scott等［4］首次通過手術(shù)改變獼猴（n=10）宮頸位置，增加逆流入腹腔的經(jīng)血而成功建立EMs模型，方法是橫斷遠(yuǎn)端宮頸，將近端宮頸穿過腹膜固定到腹直肌下，其成模率為50％，成模時(shí)間為75～963 d。1994年D′Hooghe等［5］通過將硅樹脂插入宮頸口堵塞宮頸（n=1）、電凝及縫合法閉合宮頸口（n=4）和結(jié)扎宮頸上部（n=2）3種不同方法增加狒狒經(jīng)血逆流量而建立EMs模型，這3種方法的成模率均為100％，成模時(shí)間為3個(gè)月。

手術(shù)誘導(dǎo)是將靈長類動(dòng)物子宮內(nèi)膜組織縫合到腹壁或種植到腹腔，1950年Te Linde等［6］首次將手術(shù)獲得的獼猴子宮內(nèi)膜組織（n=6）通過自體移植分別種植到前穹窿、后穹窿、闊韌帶、腸壁和腹壁成功建立EMs模型，成模率為100％，成模時(shí)間為16～522 d。2006年Hastings等［7］將連續(xù)2個(gè)月經(jīng)周期診刮獲得的狒狒子宮內(nèi)膜組織（n=24）在腹腔鏡監(jiān)視下注射到道格拉斯窩、子宮底部、后穹窿和卵巢表面，肉眼觀察的異位病灶與人類EMs相似，病理組織學(xué)證實(shí)成模率為67％，成模時(shí)間為15個(gè)月。2012年Harirchian等［8］用同樣的方法在9只狒狒盆腔成功建立EMs模型，內(nèi)膜組織種植1個(gè)月后即可觀察到紅色病變，隨后病灶經(jīng)歷藍(lán)色病變和白色病變的改變，模型成功后6個(gè)月通過手術(shù)切除和燒灼26個(gè)異位病灶觀察病灶復(fù)發(fā)情況，結(jié)果術(shù)后9個(gè)月復(fù)發(fā)率為69％，其中手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率為75％，燒灼后復(fù)發(fā)率為50％，該造模方法可模擬臨床術(shù)后復(fù)發(fā)病灶。2013年Donnez等［9］將包含交界區(qū)的狒狒子宮內(nèi)膜組織（n= 14）移植到左右髂窩成功建立了盆腔深部EMs模型，成模率為85.7％，成模時(shí)間為24周，其中66.7％的異位病灶與乙狀結(jié)腸、宮頸、大網(wǎng)膜等鄰近器官粘連，41.7％的病灶侵入直腸黏膜下層。

靈長類動(dòng)物能耐受多次手術(shù)，通過診斷性刮宮獲得子宮內(nèi)膜，并在腹腔鏡監(jiān)視下建立EMs模型，對動(dòng)物創(chuàng)傷較小，成模率較高，發(fā)病周期較短，但由于動(dòng)物有限、飼養(yǎng)條件高、所需經(jīng)費(fèi)昂貴，限制了該模型在EMs研究中的廣泛運(yùn)用。

2　嚙齒類動(dòng)物模型

嚙齒類動(dòng)物為全年多發(fā)情動(dòng)物，性成熟早，動(dòng)情周期規(guī)律，繁殖力強(qiáng)，為經(jīng)濟(jì)型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其鼠類動(dòng)情周期短，激素水平的變化與人類相似，是較理想的動(dòng)物模型。嚙齒類動(dòng)物模型包括同種移植模型和異種移植模型。

2.1同種移植模型同種移植模型是將同類或同基因動(dòng)物的子宮內(nèi)膜移植到同種動(dòng)物體內(nèi)，常用動(dòng)物為大鼠和小鼠，自體移植模型也屬于同種移植。同種移植模型方法是通過手術(shù)切除動(dòng)物子宮，用活檢穿刺針收集或直接機(jī)械分離子宮內(nèi)膜，將內(nèi)膜上皮層面向腹壁、四角縫合到腹壁上，常用組織塊大小為小鼠2～4mm2不等、大鼠5mm2［10-11］。1984年Jones等［12］首次利用SD大鼠建立自體移植模型，3周后肉眼可觀察到充滿液體的病灶，病理檢查證實(shí)為EMs。2009年DoAmaral等［13］用自體移植的方法建立Wistar大鼠EMs模型，分別于術(shù)后30d（n=15）和60d（n=15）觀察病灶，成模率分別為83.3％和71.4％，2組成模率和病灶大小、數(shù)目差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)該造模方法可行。2013年Ozer等［14］將Wistar大鼠（n=43）帶肌層的子宮內(nèi)膜縫合到腹壁內(nèi)側(cè)血管豐富區(qū)域建立EMs模型，成模率為89％，成模時(shí)間為14 d。

嚙齒類動(dòng)物模型成本低，可以從基因水平大規(guī)模地研究、評價(jià)不同時(shí)間間隔的異位病灶，使長期研究可行。但多數(shù)研究中移植的組織包含子宮肌層，在評估異位病灶的質(zhì)量和大小時(shí)，肌層所占比例較大，實(shí)驗(yàn)中移植內(nèi)膜組織塊大小的差異也可影響異位病灶的生長，多次手術(shù)創(chuàng)傷易致動(dòng)物死亡。

2.2異種移植模型異種移植模型包括組織塊移植和細(xì)胞移植，是將人的子宮內(nèi)膜組織或細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立EMs模型，常用的動(dòng)物有缺乏T淋巴細(xì)胞的裸鼠、先天性缺乏T和B淋巴細(xì)胞功能的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠以及同時(shí)缺乏自然殺傷（NK）細(xì)胞活性的非肥胖性糖尿?。∟OD）-SCID小鼠。1985年Bergqvist等［15］將EMs患者的在位及異位內(nèi)膜組織剪成直徑約2～3mm大小后同時(shí)種植到同只裸鼠（n=24）腹部皮下，移植的96個(gè)部位中有33個(gè)部位成活，成模率為34.4％，成模時(shí)間為10周。2003年Fortin等［16］將人子宮內(nèi)膜與編碼綠色熒光蛋白（GFP）的腺病毒孵育后種植到皮下，細(xì)胞表達(dá)的GFP可持續(xù)3～4周，利用熒光成像系統(tǒng)通過皮膚可以無創(chuàng)地動(dòng)態(tài)監(jiān)測異位病灶的形成和發(fā)展，但腺病毒僅可轉(zhuǎn)染15％～40％的內(nèi)膜細(xì)胞。2012年Novella-Maestre等［17］將診斷性刮宮獲得的人子宮內(nèi)膜剪成2mm×3mm大小后移植到去卵巢裸鼠腹腔（n=16），同時(shí)給予補(bǔ)充雌激素，5周后病理組織學(xué)證實(shí)成模率為100％。異種組織塊移植模型目前應(yīng)用較為廣泛，但該方法易形成炎性囊腫，從而影響盆腔微環(huán)境，且異體移植組織較小，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，手術(shù)操作困難，移植到皮下的組織因切口縫合欠佳或愈合不良，易自切口逸出，降低成模率。

2009年Banu等［18］將EMs患者的盆腔異位病灶分離培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞注射到裸鼠腹腔（n=7），形成EMs病灶，成模率為100％，成模時(shí)間為30 d，病理學(xué)證實(shí)形成的異位病灶與人類自發(fā)的腹膜EMs病灶高度吻合。與異種組織塊移植模型比較，細(xì)胞接種操作方便，細(xì)胞類型明確，可排除組織塊移植物中肌層的不利影響，同時(shí)可避免較大組織塊發(fā)生炎癥反應(yīng)所致的盆腔微環(huán)境變化，創(chuàng)傷小，且成模率高。

多數(shù)異種移植模型中給予動(dòng)物補(bǔ)充外源性人雌激素以支持人子宮內(nèi)膜組織或細(xì)胞的生長［19］，而嚙齒類動(dòng)物對雌激素高度敏感，補(bǔ)充雌激素可引起細(xì)胞增殖和子宮生長，從而引起動(dòng)物全身性改變。

3　CAM模型

CAM模型最早用于腫瘤細(xì)胞侵襲性、轉(zhuǎn)移性和血管生成潛能的研究，2003年Nap等［20］將增生期和分泌期人子宮內(nèi)膜組織以及消化培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞分別移植到CAM，種植3 d后內(nèi)膜組織可通過上皮細(xì)胞層侵入間葉細(xì)胞層形成似EMs病灶，增生期和分泌期內(nèi)膜成模率分別為68％（n=19）和67％（n= 18），而分離的子宮內(nèi)膜細(xì)胞移植后均未觀察到異位病灶。CAM具有與人類腹膜相似的細(xì)胞外間質(zhì)成分，在實(shí)驗(yàn)中異位內(nèi)膜很容易獲取且病灶容易觀察。

4　結(jié)語

動(dòng)物模型在研究EMs發(fā)病機(jī)制、病理生理學(xué)和治療中不可缺少，在實(shí)驗(yàn)中要充分考慮到不同動(dòng)物模型的適用范圍及各自潛在的局限性，如物種的代謝特性、生殖生理學(xué)和費(fèi)用比例等。靈長類動(dòng)物模型多用于EMs發(fā)病機(jī)制、免疫學(xué)特征和藥物治療等研究［21-22］。嚙齒類動(dòng)物中異種移植模型是較理想的動(dòng)物模型，多用于EMs病理生理學(xué)、探索預(yù)防性用藥及治療的研究［23-24］。人EMs裸鼠模型的建立，為研究EMs的發(fā)病機(jī)制、診斷及治療提供了理想的在體實(shí)驗(yàn)工具，熒光轉(zhuǎn)染模型雖可動(dòng)態(tài)監(jiān)測異位病灶的形成及變化，但病灶的觀察缺乏客觀標(biāo)準(zhǔn)，且僅限于疾病早期觀察，不利于長期和深部病灶的研究。CAM模型多用于EMs中血管生成機(jī)制的研究［25］，該模型不適宜研究疾病過程中的免疫、炎癥反應(yīng)和分析藥物的長期作用。今后的研究將致力于建立一種簡單、易行、創(chuàng)傷小的可視化模型用于反映EMs的發(fā)生、發(fā)展、變化過程，解釋該病的發(fā)病機(jī)制以及檢測藥物的治療效果。

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Advances in Animal Models of Endometriosis

SU Xiao-hua，SONG Dian-rong.
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China（SU Xiao-hua）；Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China（SONG Dian-rong）

SONG Dian-rong，E-mail:songdr58@126.com

2014-02-24）

［本文編輯王昕］

國家自然科學(xué)基金（81102613）

300193天津中醫(yī)藥大學(xué)（蘇曉華）；天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（宋殿榮）

宋殿榮，E-mail：songdr58@126.com

△審校者