黃凌云　秦愛平　楊敏　劉江華　全宏梅　廖斌

【摘要】目的 研究體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUECV304）在間斷性高濃度胰島素與持續(xù)性高濃度胰島素作用下誘導型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白的不同表達，從而進一步研究間斷性高濃度胰島素血癥導致動脈粥樣硬化的原因及發(fā)病機制。方法培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUECV304）為實驗對象，研究間斷性高濃度胰島素對血管內(nèi)皮細胞iNOS蛋白表達的影響。分為四組進行實驗，即間斷性高濃度胰島素波動組（含100 nmol/L胰島素的細胞培養(yǎng)液及含1 nmol/L胰島素的細胞培養(yǎng)液輪換，每隔8小時更換一次）、持續(xù)性高濃度胰島素組（含100 nmol/L胰島素的細胞培養(yǎng)液）、含正常濃度胰島素組（含1 nmol/L胰島素的細胞培養(yǎng)液）、陰性對照組（不含胰島素的細胞培養(yǎng)液）；再依次更換新鮮條件細胞培養(yǎng)液（每次培育8小時后），四組細胞均培育72小時。采用免疫細胞化學法檢測內(nèi)皮細胞iNOS蛋白表達。結果四組內(nèi)皮細胞經(jīng)含不同濃度胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時后，結果表明：正常濃度胰島素組、間斷性高濃度胰島素組、持續(xù)性高濃度胰島素組的內(nèi)皮細胞iNOS蛋白的表達水平均不同程度地增高，分別為對照組的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）、3.31倍（P<0.001），其中以間斷性高濃度胰島素組增高幅度尤為明顯，高于持續(xù)性高濃度胰島素組（P<0.001）。結論相對于持續(xù)性高濃度胰島素，間斷性高濃度胰島素更能增強人臍靜脈內(nèi)皮細胞iNOS蛋白的表達，提示間斷性高濃度胰島素可能通過影響血管內(nèi)皮細胞iNOS蛋白表達途徑而損傷血管內(nèi)皮的功能，從而促進糖尿病血管并發(fā)癥的進一步發(fā)展。

【關鍵詞】 間斷性高濃度胰島素；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；誘導型一氧化氮合酶；蛋白表達

中圖分類號：R587.3 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.01.003

高胰島素血癥是國內(nèi)外糖尿病及高血壓患者因心血管疾病死亡的重要原因[1，2] 。目前認為糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化的危險性與高血糖、高胰島素血癥、異常脂血癥等眾多病理因素有關。有臨床研究表明在肥胖和超重兒童中有高胰島素血癥者占總?cè)藬?shù)的44.7%[3]。因為胰島素抵抗而產(chǎn)生隨之而來的高胰島素血癥存在于許多疾病中，是糖尿病早期的癥狀之一[4]。而且基礎動物研究發(fā)現(xiàn)，使孕期懷孕大鼠血壓升高的主要原因為高胰島素血癥[5]。但高胰島素血癥如何導致動脈粥樣硬化發(fā)生的病理機制至今尚未完全闡明。目前許多學者認為內(nèi)皮細胞功能受損是眾多血管性疾病發(fā)生的始動步驟。因此，深入開展高胰島素血癥致內(nèi)皮功能損傷機理的研究將有利于進一步闡明糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)病機制。有研究表明：通過免疫炎癥反應高濃度胰島素參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[6]。鑒于內(nèi)皮細胞一氧化氮（NO）分泌的異常變化是內(nèi)皮細胞受損的最早期表現(xiàn)并且加入炎癥反應，且誘導型一氧化氮合酶（iNOS）與炎癥反應相關?？紤]糖尿病（2型）是一種慢性炎癥性疾病，很多炎癥因子加入2型糖尿病的發(fā)生及其并發(fā)癥的發(fā)展[7，8]。所以我們研究含不同高濃度胰島素形成的間斷性高濃度胰島素培養(yǎng)液培養(yǎng)下的內(nèi)皮細胞iNOS蛋白水平表達，與含持續(xù)性高濃度胰島素細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)下的內(nèi)皮細胞iNOS蛋白水平表達有何不同的影響，旨在進一步探索間斷性高胰島素血癥促進動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的病理生理機制，進而為糖尿病血管并發(fā)癥的防治及胰島素的合理應用開辟新的途徑。1材料與方法1.1實驗材料和試劑 自通化東寶藥業(yè)股份有限公司購重組人胰島素（甘舒霖R）；自中南大學湘雅醫(yī)學院細胞典藏中心購內(nèi)皮細胞株（HUECV304）細胞；自杭州四季青公司購胎牛血清（FBS）和新生牛血清；自Gibco公司購DMEM細胞培養(yǎng)基（低糖型）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2實驗方法和步驟

1.2.1內(nèi)皮細胞的傳代培養(yǎng)及鑒定先將HUECV304放入含5%二氧化碳的37℃（持續(xù)恒溫）細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。等待細胞長成亞融合狀態(tài)時，再用1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化細胞3～5 min，待細胞消化至皺縮、彼此分離抑或呈大片狀分離形態(tài)時即吸去消化液，再滴入適當量的含20%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液用來終止細胞消化。然后，將大片狀分離細胞吹打成單細胞懸液，待計數(shù)后用無菌吸管按1×105/ml等量吸取細胞至新的細胞無菌培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，將細胞靜止培養(yǎng)4～6小時，待細胞固定后再更換培養(yǎng)液，用倒置相差顯微鏡觀察新生代細胞的形態(tài)特點。用Ⅷ因子抗原免疫細胞化學檢測（+）方法鑒定實驗細胞為內(nèi)皮細胞株，待細胞生長至80%融合后，取生長狀態(tài)好的對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2實驗分組及處理取生長良好的對數(shù)期內(nèi)皮細胞用于實驗，待細胞接近融合時，為了使細胞同步，四組均換上不含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培育一天，再換用低糖型DMEM條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。實驗分組如下：①間斷性高濃度胰島素組（含1 nmol/L胰島素及100 nmol/L胰島素兩種條件培養(yǎng)液，每間隔8小時更換1次條件培養(yǎng)液，簡稱間斷性高濃度胰島素組）；②持續(xù)性高濃度胰島素組（含100 nmol/L胰島素）；③正常濃度胰島素組（含1 nmol/L胰島素）；④陰性對照組（不含胰島素），按照時間更換一次新鮮條件培養(yǎng)液（每間隔8小時），共培育細胞72小時后行相關指標檢測。

1.2.3應用SP試劑盒免疫細胞化學檢測iNOS基因蛋白表達水平 （1）先將傳代細胞加入已放入蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當細胞長至50%～60%融合時，再加入條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞72小時。（2）吸出條件培養(yǎng)液后先用PBS沖洗5次，再使用95%酒精固定30 min。（3）水化：先用無水乙醇作用3次，每次5 min；再用95%乙醇作用3次，每次5 min，然后用75%乙醇作用3次，每次5 min。（4）加入hydrogen peroxide 室溫阻滯10～15 min，然后用001 M平衡鹽緩沖液沖洗細胞4次，每次沖洗5 min。（5）加入ULtra Ⅴ阻斷劑，室溫阻滯5 min，再0.01 M平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次5 min。（6）加入一抗（兔抗人iNOS抗體），于4℃過夜，再用0.01 M平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次5 min。（7）加入二抗（羊抗兔）室溫孵育10 min后用0.01 M PBS緩沖液沖洗4次，每次5 min。（8）加入streptavidin peroxidase，室溫培養(yǎng)10 min，再用0.01 M平衡鹽緩沖液沖洗細胞4次，每次5 min。（9）加DAB顯色劑至細胞培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板室溫孵育，顯微鏡下觀察，5～15 min（視染色深淺而定）后，再用001 M平衡鹽緩沖液沖洗4次，每次5 min。（10）再加入1%HCl 70%酒精淡化及二甲苯透明。（11）用酒精脫水：先用75%乙醇脫水3次，每次5 min，再用95%乙醇脫水3次，每次5 min，最后用無水乙醇脫水3次，每次5 min。（12）最后晾干，用中性樹脂封片保存。endprint

1.2.4結果判定 細胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性染色，細胞中未出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陰性染色。最后均采用Image J 1.34軟件進行分析處理所有圖像資料。

1.3統(tǒng)計學方法 建立數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，用均數(shù)±標準差（±s）表示計量數(shù)據(jù)，資料符合正態(tài)分布及方差齊性，用單向方差分析法（Oneway ANOVA）進行組間比較，P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果待不同濃度胰島素組處理內(nèi)皮細胞72小時后，用免疫細胞化學方法檢測iNOS蛋白表達水平，結果提示：正常濃度組、間斷性高濃度胰島素組、持續(xù)性高濃度胰島素組的內(nèi)皮細胞iNOS蛋白的表達水平均呈現(xiàn)不同程度的增加，分別為對照組的1.92倍（P<0001）、4.52倍（P<0001）及3.31倍（P<0001）。其中以間斷性高濃度胰島素組增高幅度尤為明顯，且與持續(xù)性高濃度胰島素組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0001）。各組內(nèi)皮細胞圖像見圖1A～D。對各組細胞的免疫細胞化學圖像采用Image J 134圖像分析軟件進行分析，結果見表1。

圖1各組內(nèi)皮細胞圖像（SP法：×400）。A： 陰性對照組；B：正常濃度胰島

素組；C：持續(xù)性高濃度胰島素組；D：間斷性高濃度胰島素組。

3討論高胰島素血癥是心血管疾病及糖尿病、高血壓病等多種疾病的病理生理基礎[9]，所以目前臨床內(nèi)分泌學已有大量研究關注高胰島素血癥與動脈粥樣硬化的關系。許多臨床研究表明，內(nèi)源性高胰島素

表1各組iNOS蛋白表達 （n=3，±s）

組別iNOS蛋白陰性對照組10.3±0.8正常濃度胰島素組 19.8±0.7a持續(xù)性高濃度胰島素組34.1±1.0ab間斷性高濃度胰島素組46.6±1.3abcF799.31P0.000注：與陰性對照組比較，aP<0.001；與正常濃度胰島素組比較，bP<0.001；與持續(xù)性高濃度胰島素組比較，cP<0.001。

血癥產(chǎn)生的原因為肥胖所導致的內(nèi)源性胰島素抵抗[10]。高胰島素血癥出現(xiàn)于高血壓及冠心病患者及其一級親屬中[11]。有臨床研究顯示，2型糖尿病并肥胖患者因胰島素抵抗具有內(nèi)源性高胰島素血癥，1型糖尿病患者產(chǎn)生高胰島素血癥的原因是因為需要注射胰島素降糖治療[12]。2型糖尿病并肥胖患者體內(nèi)空腹胰島素水平異常增高（因為存在胰島素抵抗）；在應用口服刺激β細胞分泌降血糖藥后又會人為地造成餐后高胰島素血癥；而1型糖尿病患者需要外源性胰島素治療，由于胰島素治療往往超過人正常胰島素分泌量才有治療效果，加上注射的胰島素不需先通過肝臟代謝而是直接進入人體循環(huán)，使得糖尿病患者全天某時段或全天外周血管血漿胰島素水平總高于生理濃度，從而導致使用外源性胰島素治療的2型及1型糖尿病患者伴發(fā)的冠狀動脈事件發(fā)生率大幅度升高[13]。提示無論是外源性還是內(nèi)源性高胰島素血癥，均可能在糖尿病患者動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展過程中具有十分重要的作用。然而，對高胰島素血癥是如何誘發(fā)及促進動脈粥樣硬化的病理機制目前尚缺乏深入了解。血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病患者發(fā)生多種心血管疾病共同的病理生理改變。因此對高胰島素血癥導致內(nèi)皮功能障礙的原理及其發(fā)生機理的研究具有重要意義。近年來研究表明，內(nèi)皮細胞損傷在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的基礎作用。動物研究表明在內(nèi)皮細胞胰島素抵抗的小鼠容易出現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化[14]。內(nèi)皮依賴性胰島素抵抗可導致內(nèi)皮細胞活性氧增加，引起血管舒張功能障礙。同樣胰島素還可通過影響iNOS基因表達的多態(tài)性進而影響內(nèi)皮功能[15]。臨床研究表明存在胰島素抵抗的糖尿病患者，每天由于進食、口服刺激β細胞分泌胰島素的降糖藥及注射外源性胰島素等因素，導致血漿胰島素水平會出現(xiàn)空腹高胰島素狀態(tài)及餐后高胰島素狀態(tài)，并不可能長期維持穩(wěn)定濃度的高胰島素狀態(tài)，血漿胰島素水平總會在一定濃度水平范圍出現(xiàn)頻繁的異常波動形態(tài)，導致間斷性高濃度胰島素血癥。然而間斷性高濃度胰島素血癥對血管內(nèi)皮細胞的影響尚未見報道，故本實驗研究間斷性高濃度胰島素對iNOS蛋白表達的影響，以闡明間斷性高濃度胰島素血癥導致血管內(nèi)皮損害的可能機制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)含不同濃度胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)內(nèi)皮細胞72小時后，正常濃度胰島素組、間斷性高濃度胰島素組及持續(xù)性高濃度胰島素組的內(nèi)皮細胞iNOS蛋白的表達水平均出現(xiàn)不同程度的增加，分別為對照組的1.92倍（P<0.001）、4.52倍（P<0.001）及3.31倍（P<0.001），以間斷性高濃度胰島素組上調(diào)幅度尤為明顯，顯著高于持續(xù)性高濃度胰島素組（P<0.001）。

綜上所述，本研究首次提出了間斷性高濃度胰島素血癥的概念，并對間斷性高濃度胰島素對血管內(nèi)皮細胞功能的影響進行了研究。結果顯示：間斷性高濃度胰島素相對于持續(xù)性高濃度胰島素更能上調(diào)iNOS蛋白表達，表明間斷性高濃度胰島素血癥可能是一種重要的致動脈粥樣硬化的危險因素。因此這不僅僅為糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化提供相應的理論基礎，而且可能為指導糖尿病患者的合理胰島素治療提供臨床依據(jù)。同時提示我們在臨床實踐中，不僅僅要防止形成空腹及餐后高胰島素血癥，而且要盡量避免體內(nèi)血漿胰島素處于頻繁波動狀態(tài)，這可能對延緩糖尿病血管病變的發(fā)生及發(fā)展有著十分重要的基礎及臨床意義。參考文獻[1] Lastra G，Dhuper S，Johnson MS，et al.Salt，aldosterone，and insulin resistance：impact on the cardiovascular system[J].Nat Rev Cardiol，2010，7（10）：577584.

[2] De Filippo G，Rendina D，Strazzullo P.Childhood obesity，other cardiovascular risk factors，and premature death[J].N Engl J Med，2010，362（19）：18411842.endprint

[3] A1Agha A，Ochehree A，Shata N.Prevalence of hyperinsulinism，type 2 diabetes mellitus and metabolic syndrome among Saudi overwelght and obese pediatric patients[J].Minerva Pediatr，2012，64（6）：623631.

[4] Liu Y，Li J，Zhang Z，et al.Effects of exercise intervention on vascular endothelium functions of impaired glucose tolerance patients during prediabetes mellitus[J].Exp Ther Med，2013，5（6）：15591565.

[5] Palei AC，Spradley FT，Granger JP.Euglycemic hyperinsulinemia increases blood pressure in pregnant rats independent of placental antiangiogenic and inflammatory factors [J].Am J Hypertens，2013，26（12）：14451451.

[6] 葉雙櫻，陳禮平，武蓉珍，等.高濃度胰島素對急性冠狀動脈綜合征患者外周單核細胞源樹突狀細胞分化成熟及免疫功能的影響[J].中國動脈硬化雜志，2011，19（1）：6165.

[7] Hotamisligil GS.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease[J].Cell，2010，140（6）：900917.

[8] Goldberg RB.Cytokine and cytokinelike inflammation markers，endothelial dysfunction，and imbalanced coagulation in development of diabetes and its complications[J]. J Clin Endocrinol Metab，2009，94（9）：31713182.

[9] Hegele RA，Pollex RL.Genetic and physiological insights into the metabolic syndrome[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，289（3）：663669.

[10] Groop LC.Insulin resistance： the fundamental trigger of type 2 diabetes[J].Diabetes Obes Metab，1999，1（Suppl 1）：S1S7.

[11] Reaven GM.Insulin resistance/compensatory hyperinsulinemia，essential hypertension，and cardiovascular disease[J].J Clin Endocrinol Metab，2003，88（6）：23992403.

[12] Straczkowski M，Kowalska I.Insulin resistance in the firstdegree relatives of persons with type 2 diabetes [J].Med Sci Monit，2003，9（5）：CR186190.

[13] 王旭開，楊成明，王紅勇，等.醫(yī)源性不同胰島素劑量對中年2型糖尿病患者合并冠狀動脈事件的作用[J].中國動脈硬化雜志，2005，13（3）：345347.

[14] Sukumar P，Viswambharan H， Imrie H， et al.Nox2 NADPH oxidase has a critical role in insulin resistancerelated endothelial cell dysfunction[J].Diabetes，2013，62（6）：21302134.

[15] Galluccio E，Piatti P，Citterio L，et al.Hyperinsulinemia and impaired leptinadiponectin ratio associate with endothelial nitric oxide synthase polymorphisms in subjects with instent restenosis[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，294（5）：978986.

（收稿日期：2014-12-17修回日期：2015-01-27）

（編輯：潘明志）endprint