劉 浩，趙旭德，劉夢(mèng)琳，李勝方，王啟爍，陶 敏，*

(1湖北理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖北黃石435003;2湖北理工學(xué)院礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃石435003;3中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，湖北武漢430072)

0 引言

上世紀(jì)80年代末，由于有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphate Pesticides，OPPs)具有藥效高、應(yīng)用廣泛、種類繁多、易降解、殘留毒素較低等特點(diǎn)，逐步取代了大范圍使用的有機(jī)氯農(nóng)藥，成為全球使用范圍最為普遍的一種殺蟲劑［1］。然而，OPPs 并非如人們想象的那么安全，它也可能在環(huán)境中蓄積，對(duì)環(huán)境生態(tài)造成較大的損害。近年來，隨著對(duì)OPPs 環(huán)境化學(xué)行為和環(huán)境毒理性質(zhì)研究的不斷深入，人們逐漸意識(shí)到OPPs 在給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來收益的同時(shí)也帶來了一定的隱憂，一些難降解、脂溶性強(qiáng)的有機(jī)農(nóng)藥通過水循環(huán)和食物鏈富集發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化，長(zhǎng)期食用含有這些農(nóng)藥殘留的水產(chǎn)品可致畸、致癌，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅［2－4］。因此，如何高效安全地處理含有機(jī)磷農(nóng)藥的污水或受污染水體對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康有著非常重要的意義。

敵百蟲(O，O－二甲基－(2，2，2－三氯－1－羥基乙基)膦酸酯)是1952年德國(guó)拜耳公司開發(fā)的一種中毒、高效、廣譜有機(jī)磷殺蟲劑，它廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)上的殺蟲和消毒［5－6］。盡管敵百蟲作為中低毒農(nóng)藥推薦使用，但其在弱堿性條件下可脫去一分子氯化氫而形成毒性增大約10 倍的敵敵畏，具有誘發(fā)染色體變異作用，存在致癌的危害。據(jù)研究表明，長(zhǎng)期處于敵百蟲的暴露下，魚體內(nèi)的對(duì)氧磷酶、乙酰膽堿酯酶的活性顯著降低，導(dǎo)致魚體受損和生理機(jī)能下降［7］。敵百蟲還可引起細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。

目前，國(guó)內(nèi)外有機(jī)磷農(nóng)藥污染修復(fù)的方法主要有物理法(超聲波技術(shù)、吸附、洗滌和電離輻射等)［9－10］、化學(xué)法(水解、氧化分解和光化學(xué)降解等)［11－12］和生物降解法(植物修復(fù)、微生物修復(fù)、降解酶和工程菌降解等)［13－15］。其中，植物修復(fù)(Phytoremediation)技術(shù)具有投入低、治理效果明顯、不易產(chǎn)生副作用、可恢復(fù)和建設(shè)生態(tài)環(huán)境的特點(diǎn)，已經(jīng)成為環(huán)境污染治理的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)［16］。有研究［17－18］表明，鳳眼蓮、苜蓿、香蒲等植物能夠有效地去除水體中的PAHs、DDT、馬拉硫磷、三唑磷等。另外，植物可通過釋放水解酶、過氧化物酶等胞外酶直接降解多氯聯(lián)苯和酚類有機(jī)物［19］，或通過分泌有機(jī)酸和酚類物質(zhì)刺激微生物活性，間接促進(jìn)有機(jī)物降解［20］。可見，利用植物修復(fù)技術(shù)不僅能起到凈化水體的作用，還能夠改善水體生態(tài)環(huán)境。

本文以有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲為試驗(yàn)對(duì)象，研究美人蕉、菖蒲和鳳眼蓮3 種水生、濕生植物對(duì)水體有機(jī)磷農(nóng)藥的降解效果，篩選出修復(fù)效果好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的植物;并探討了不同敵百蟲濃度脅迫下水生植物的生理生化特性變化，從有機(jī)物降解酶活性方面揭示有機(jī)磷農(nóng)藥降解的生物學(xué)機(jī)制，為植物修復(fù)水體有機(jī)磷農(nóng)藥污染提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)系統(tǒng)

本試驗(yàn)系統(tǒng)由12 個(gè)5 L 的容器組成，依次編號(hào)為1，2，3，…，10，11，12。在編號(hào)1，2，3 的容器中均放入2 L 以磁湖污水配置的敵百蟲溶液，敵百蟲濃度分別為3 mg/L、15 mg/L、30 mg/L，然后將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的美人蕉移入系統(tǒng)中，每組3 棵左右。編號(hào)4，5，6 和7，8，9 容器的操作步驟同上，所不同的是移入的植物分別為鳳眼蓮和菖蒲。編號(hào)10，11，12的容器為無植物空白對(duì)照組，其他條件一致，所有試驗(yàn)組均在臨窗自然光條件下培養(yǎng)，試驗(yàn)系統(tǒng)示意圖如圖1所示。試驗(yàn)系統(tǒng)中水體理化指標(biāo)分別為:pH 7.90、DO 3.27 mg/L、COD 85.3mg/L、TN 5.78 mg/L、TP 0.21 mg/L。試驗(yàn)時(shí)間為2013年9月至2013年10月，分別采集試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束后的各系統(tǒng)中植物的根部，用蒸餾水清洗干凈后，迅速放入冰箱中低溫保存(－4 ℃);另外，試驗(yàn)結(jié)束后采集各系統(tǒng)中的水樣，測(cè)定水溶液中敵百蟲的殘余量。

圖1 試驗(yàn)系統(tǒng)示意圖

1.2 水體中敵百蟲含量的測(cè)定

敵百蟲的含量采用自動(dòng)電位滴定儀進(jìn)行測(cè)定，即準(zhǔn)確量取敵百蟲樣品溶液100 mL，置于250 mL 錐形瓶中，加入40 mL 乙醇溶液，置于30 ±0.5 ℃的恒溫水浴中，靜置10 min，加入5 mL 碳酸鈉溶液，放置10 min 后立即緩慢加入10 mL 硝酸溶液，然后從恒溫水浴中取出，將溶液轉(zhuǎn)入250 mL 燒杯中，用硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行電位滴定。最后，按照以下公式計(jì)算樣品中敵百蟲的含量:

式(1)中:W(敵百蟲)為敵百蟲樣品溶液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%;C 為硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L;V 為試樣測(cè)定時(shí)消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;V0為空白測(cè)定時(shí)消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;C樣為試樣溶液中敵百蟲初始濃度，g/mL;C0為空白試樣溶液中敵百蟲初始濃度，g/mL;0.01 為量取的試樣溶液的體積，mL;0.257 4 為敵百蟲分子的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol;1.01 為校正系數(shù)。

1.3 植物酶活性的測(cè)定

1.3.1 SOD 活性測(cè)定

SOD 活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法，即稱取植物根部0.5 g，先加入2.5 mL PBS，研磨勻漿后，再加入2.5 mL PBS 混勻，－4 ℃下10 000 r/min 離心15 min，上清液即為粗酶液。取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。取10 mL 小燒杯7 只，其中3 只用作測(cè)定樣品，4 只作為對(duì)照。SOD 活性測(cè)定所用試劑及其用量如表1所示，按照表1 中的用量加入試劑。

將上述試劑混勻后，1 只對(duì)照燒杯置于暗處，另3 只對(duì)照燒杯和樣品一起置于4 000 lx日光燈下反應(yīng)20 min(要求各管受光一致，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，溫度低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間)，最后在560 nm 處測(cè)定反應(yīng)液的光密度。以不照光的對(duì)照燒杯作參比，分別測(cè)定其他各管的光密度。按照下式計(jì)算SOD 活性:

式(2)中，SOD 總活性以U/gFW 表示;ACK為對(duì)照燒杯(照光)的光吸收值;AE 為樣品的光吸收值;V 為樣液總體積;Vt 為測(cè)定時(shí)樣品用量;W 為樣重，g。

表1 SOD 活性測(cè)定所用試劑及其用量

1.3.2 POD 活性測(cè)定

POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，即稱取植物根部0.25 g，加入5 倍量(m /v)的pH7.0 PBS，冰浴研磨，15 000 r/min 離心15 min，取部分上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后用于酶活性測(cè)定。在3 mL 的反應(yīng)體系中，加入0.3% H2O21 mL、0.2%愈創(chuàng)木酚0.95 mL，pH7.0 PBS 1 mL，最后加入0.05 mL 酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄470 nm 處OD 增加速度。將每分鐘OD 增加0.01 定義為1 個(gè)活力單位，以U/gFW 表示。

1.3.3 MDA 含量的測(cè)定

丙二醛(MDA)的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，即取0.5 g 植物樣品，先加入10% TCA 2 mL 研磨勻漿后再加入3 mL TCA 進(jìn)一步研磨，研磨后所得勻漿在3 000 r/min 下離心10 min，取上述步驟所得的上清液2.0 mL 于帶塞試管中(可做2 個(gè)重復(fù))，加入0.5% TBA 溶液2.0 mL，混合后于沸水浴上反應(yīng)20 min，迅速冷卻后離心，上清液分別于532 nm、600 nm 及450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值。對(duì)照管以2 mL 水代替提取液。按照MDA 濃度C(μmol/L)= 6.45(OD532－OD600)－0.56OD450計(jì)算MDA 含量，然后以植物鮮重表示丙二醛含量:MDA(μmol/gFW)。

2 結(jié)果與討論

2.1 3 種植物對(duì)不同濃度敵百蟲的去除率

3 種植物對(duì)不同濃度敵百蟲的去除率如圖2所示。從圖2 可以看出，無植物空白系統(tǒng)中敵百蟲有一定的降解，這可能是由于水體的弱堿環(huán)境(pH =7.90)導(dǎo)致敵百蟲轉(zhuǎn)化為敵敵畏的緣故。美人蕉和鳳眼蓮對(duì)敵百蟲的去除率明顯高于空白系統(tǒng)，而菖蒲對(duì)敵百蟲的去除較空白系統(tǒng)有一定的提高。在不同濃度敵百蟲的脅迫下，3 種植物對(duì)敵百蟲的去除效果均表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即美人蕉＞鳳眼蓮＞菖蒲。成水平等［21］研究發(fā)現(xiàn)美人蕉對(duì)水體三唑磷的去除率為41% 左右，本試驗(yàn)條件下美人蕉對(duì)敵百蟲的去除率為50.3% ～63%，去除效果較好。此外，敵百蟲初始濃度為3 mg/L時(shí)，3 種植物均對(duì)水體敵百蟲的去除率最高，隨著敵百蟲初始濃度的升高，植物對(duì)其去除率逐步降低，這可能是由于過高的敵百蟲濃度會(huì)抑制植物根部降解酶的活性以及影響植物根際的礦化作用所致［22］。

圖2 3 種植物對(duì)不同濃度敵百蟲的去除率

2.2 不同濃度敵百蟲對(duì)植物MDA 含量的影響

MDA 的濃度常用來表示脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)的受傷害程度，是反映植物抗逆境強(qiáng)弱的生理指標(biāo)［23］。不同濃度敵百蟲對(duì)3 種植物根部MDA 含量的影響如圖3所示，從圖3中可以看出，在不同濃度敵百蟲的脅迫下，3種植物根部MDA 的含量均有不同程度的升高;其中菖蒲根部MDA 含量增長(zhǎng)最快，從0.056 μmol/gFW 增長(zhǎng)到0.247 μmol/gFW，但是鳳眼蓮和美人蕉根部MDA 的含量都不隨著敵百蟲濃度的升高而增大?？梢?，不同濃度敵百蟲脅迫下，鳳眼蓮和美人蕉根部膜系統(tǒng)受傷害程度不大，而菖蒲則表現(xiàn)出較差的抗逆境生理特性。另外，從圖3 中還可發(fā)現(xiàn)，美人蕉根部MDA 含量是3 種植物中最低的，表明敵百蟲脅迫下美人蕉受到的損傷最小，即美人蕉保持正常生理代謝活動(dòng)的能力較強(qiáng)，這也正是美人蕉對(duì)敵百蟲去除效果較好的原因。

圖3 不同濃度敵百蟲對(duì)植物根部MDA 含量的影響

2.3 不同濃度敵百蟲對(duì)植物SOD 活性的影響

SOD 是植物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的一種重要的抗氧化酶，有助于植物清除氧自由基，其活性大小反映植物的抗逆性能力。不同濃度敵百蟲對(duì)植物根部SOD 活性的影響如圖4所示，由圖4可知，在敵百蟲脅迫下，3 種植物根部SOD 酶的活性都表現(xiàn)出不同程度的上升，其中鳳眼蓮和美人蕉根部SOD 酶的活性均在敵百蟲低濃度脅迫時(shí)較大，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性能力，而在高濃度脅迫下其抗逆性都有一定的降低?？梢?，在敵百蟲有機(jī)磷農(nóng)藥脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)SOD 酶活性阻止細(xì)胞受到氧自由基的侵害，在一定程度上增強(qiáng)了植物對(duì)逆境的耐受性;但是SOD 酶對(duì)植物的保護(hù)作用是有限的，當(dāng)敵百蟲的脅迫超出植物的耐受范圍時(shí)，反而會(huì)對(duì)植物根部SOD 的活性產(chǎn)生抑制作用［24］。

圖4 不同濃度敵百蟲對(duì)植物根部SOD 活性的影響

2.4 不同濃度敵百蟲對(duì)植物POD 活性的影響

POD 是清除活性氧H2O2的重要保護(hù)酶類，能將H2O2分解為O2和H2O，從而降低H2O2對(duì)植物的毒害。不同濃度敵百蟲對(duì)植物根部POD 活性的影響如圖5所示，由圖5 可知，鳳眼蓮根部POD 的活性最高，其次是美人蕉，而菖蒲根部POD 的活性最小。鳳眼蓮根部POD 酶的活性隨著敵百蟲濃度的升高表現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，表明敵百蟲農(nóng)藥對(duì)鳳眼蓮的正常生理代謝產(chǎn)生了顯著的脅迫作用，使其對(duì)外界的抵抗力下降。在低濃度敵百蟲脅迫下，菖蒲根部POD 的活性有一定的升高，但當(dāng)敵百蟲濃度高于3 mg/L 時(shí)，菖蒲根部POD 的活性迅速降為0，說明敵百蟲對(duì)菖蒲根部造成了嚴(yán)重?fù)p害。美人蕉根部POD 的活性隨著敵百蟲濃度的升高幾乎不變，這表明美人蕉根部受到敵百蟲的脅迫不明顯。

圖5 不同濃度敵百蟲對(duì)植物根部POD 活性的影響

3 結(jié)論

1)在不考慮蒸發(fā)量影響的情況下，3 種水生植物均促進(jìn)了水體中敵百蟲的降解，鳳眼蓮、菖蒲、美人蕉對(duì)敵百蟲的平均去除率較無植物系統(tǒng)分別提高了21.55%、10.04%、33.83%，其修復(fù)能力大小依次為美人蕉＞鳳眼蓮＞菖蒲。因此，在選擇水生植物修復(fù)水體有機(jī)磷農(nóng)藥敵百蟲時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮美人蕉。

2)不同濃度敵百蟲對(duì)3 種水生植物根部的生理生化特征均有一定的影響，低濃度時(shí)可誘導(dǎo)植物根部解毒酶活性的增強(qiáng)，而較高濃度時(shí)植物正常生理代謝受到了抑制。在敵百蟲脅迫下，美人蕉根部MDA 的含量是3 種植物中最低的，SOD 的活性在3 種植物中最高，表明美人蕉受到的損傷最小，具有較強(qiáng)的抗逆性能力。

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