李明軍,榮向輝,李英夫,呂霽

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

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攜載紫杉醇的納米粒子靶向治療腦膠質(zhì)瘤的研究進展①

李明軍,榮向輝,李英夫,呂霽

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；紫杉醇；血腦屏障；多功能納米粒子；靶向

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病之一，我國腫瘤最新發(fā)病率已達千分之二，死亡率為千分之一點五。腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的腦腫瘤,也是死亡率最高的十大腫瘤之一，以及腦膠質(zhì)瘤瘤體細(xì)胞呈浸潤性生長的特點,使得目前治療腦膠質(zhì)瘤的主要手段是手術(shù)切除配合放、化療,但是均很難以達到良好的治療目的[1，2]，這是腦神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤治療的最大障礙。而且神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織的微環(huán)境與正常組織存在顯著的差別，血腦屏障(BBB)的存在不利于藥物通過血管輸送到腫瘤組織的深部及細(xì)胞內(nèi)藥物作用的靶位。惡性腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后中位生存期很短，尚不足兩年。因此如何選擇合適的抗腫瘤藥物，可通過BBB、靶向腫瘤微環(huán)境、提高藥物對腫瘤組織的選擇性和滲透性并能跨膜輸送至細(xì)胞內(nèi)達到有效濃度已經(jīng)成為腦腫瘤治療的新挑戰(zhàn)。

紫杉醇(Paclitaxel, 簡稱PTX)是從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)中提取的雙萜類天然產(chǎn)物又經(jīng)化學(xué)修飾合成, 為一類新型抗腫瘤藥物[3]，其作用機理以穩(wěn)定微管并防止微管解聚及調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)，從而使腫瘤細(xì)胞無法有效分裂而死亡。然而, 由于紫杉醇資源匱乏,水溶性低,難以通過血腦屏障等, 使其在臨床上在腦部腫瘤，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的應(yīng)用治療受到很大程度的限制[4]。因此，研發(fā)新型紫杉醇載藥體系和劑型及研究其抗腫瘤活性，靶向作用于腦部腫瘤，對于臨床治療腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤用藥具有非常重要的意義[5]。

1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析

由于血腦屏障的存在，使紫杉醇等抗腫瘤藥物不能在腦內(nèi)富集發(fā)揮藥效，限制了紫杉醇在腦部腫瘤治療中的應(yīng)用，而且腫瘤組織的微環(huán)境與正常組織存在顯著的差別，不利于藥物通過血管輸送到腫瘤組織的深部及細(xì)胞內(nèi)藥物作用的靶位。應(yīng)用納米載藥系統(tǒng)解決抗腫瘤藥物透過血腦屏障、實現(xiàn)藥物在腦內(nèi)的富集腦靶向問題吸引了廣大科研人員注意力。利用納米微粒作為小分子抗腫瘤藥物靶向傳遞系統(tǒng)的研究正在快速的發(fā)展和進行中。這種納米載藥系統(tǒng)不僅能夠改善療效、提高抗腫瘤藥物的生物利用率、減少臨床用藥量、減輕或消除毒副作用，還具有藥物釋放的可控性和腫瘤靶向定位的優(yōu)點。因此，腫瘤的靶向治療應(yīng)運而生并且迅速成為研究的熱點。

1.1 多功能串聯(lián)肽裝飾的紫杉醇脂質(zhì)體

由于血-腦屏障(BBB)的原因，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物治療存在極大的挑戰(zhàn)。為了使藥物能特異性地積聚在腦膠質(zhì)瘤病灶和進入大腦后滲透到腫瘤核心，降低對正常腦組織毒性，實現(xiàn)有效的治療。LiuY等人在這項研究中，將一個特定的環(huán)狀配位體RGD肽綴合至于細(xì)胞穿透肽R8上開發(fā)一種多功能肽R8-RGD。與單獨R8和RGDR相比較，分別與顯示的三維膠質(zhì)瘤球體和血腦屏障模型體外實驗有效穿透性，8-RGD擁有通過2～30倍的增加脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取量。C6膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠體內(nèi)研究表明，R8-RGD-脂全身給藥后可以有效地輸送到大腦和選擇性累積在膠質(zhì)瘤灶。當(dāng)在脂質(zhì)體載紫杉醇(PTX)，R8-RGD-脂可對C6細(xì)胞細(xì)胞凋亡引起強烈的抑制，在顱內(nèi)膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠獲得的最長存活時間。最后，所有的結(jié)果表明，在串聯(lián)肽R8-RGD是一個有希望的具有多功能配位體，包括血腦屏障輸送，神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向和腫瘤穿透性。R8-RGD-脂被證明是一個潛在的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的藥物遞送系統(tǒng)[6]。

1.2 裝飾EGFP-EGF1(ENP)納米顆粒靶向腦膠質(zhì)瘤的新生血管和膠質(zhì)瘤治療

新生血管和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具密切相關(guān)性，可能是相互促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長，針對這兩個方向我們研究，與那些針對其中的一個方向的相比較，我們發(fā)現(xiàn)針對新生血管和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞雙靶向策略是更有前途的。在我們報道的藥物遞送系統(tǒng)，其中納米顆粒被飾以EGFP-EGF1(ENP)，來自于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中VII因子與組織因子(TF)融合蛋白的的特殊親合力的過表達的研究。通過針對新生血管和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞這兩個方面的研究，體外蛋白質(zhì)結(jié)合測定法表明：EGFP-EGF1作用至C6細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)形成的人工血管模型EGFP-EGF1-TF的相互作用顯著增強納米顆粒攝取、HUVEC和神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞以及C6膠質(zhì)瘤球狀納米顆粒的滲透，并由此，它們有效通過兩個單層細(xì)胞層和提高了對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞毒性作用。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的小鼠的體內(nèi)成像證實ENP在膠質(zhì)瘤組織中特異性蓄積。納米顆粒體內(nèi)分布直觀地表明ENP主要作用于兩個血管外的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新生血管細(xì)胞。藥效學(xué)結(jié)果表明，與其他組進行比較，加載ENP的PTX(ENP-PTX)顯著延長神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠的平均存活時間。與其他治療方法相比，TUNEL法和HE染色顯示ENP-PTX治療引起的顯著腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤壞死?？傊Y(jié)果證明EGFP-EGF1功能化納米粒子對腦膠質(zhì)瘤雙靶向的治療具有巨大發(fā)展?jié)摿7]。

1.3uPA激活細(xì)胞穿透肽(ACPP)的多靶向性藥物傳遞系統(tǒng)

經(jīng)過研究，現(xiàn)在大家都明白腫瘤的生長是多途徑的綜合結(jié)果，神經(jīng)膠質(zhì)瘤實質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞是密切相關(guān)的，相互代償?shù)?。因此，針對他們兩者的給藥策略，可能獲得更多有前途的治療效果。ZhangB,等在研究中，開發(fā)了用于治療腦膠質(zhì)瘤(ANP)的改性的uPA激活細(xì)胞穿透肽(ACPP)的多靶向性藥物傳遞系統(tǒng)。體外實驗證明，與傳統(tǒng)相比飾有細(xì)胞穿透肽(CPP)或ACPP納米粒子能顯著提高C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的吸收球狀納米顆粒(NP和納米粒子滲透到神經(jīng)膠質(zhì)瘤)的能力，在活體動物實驗表明，ANP腦膠質(zhì)瘤的細(xì)胞內(nèi)積累比NP裝飾帶或不帶CPP了更具體。ACPP促成膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)納米顆粒積累，ANP不僅能夠定位于膠質(zhì)瘤薄壁細(xì)胞，也可與基質(zhì)細(xì)胞，包括新血管細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。證明ACPP藥效學(xué)結(jié)果由納米顆粒顯著延長荷瘤小鼠的存活時間，可顯著改治療效果。結(jié)果表明，納米改性的uPA敏感ACPP可達到多種類型的細(xì)胞組織，并提供一種新的膠質(zhì)瘤靶向治療策略[8]。

1.4 裝載紫杉醇腦靶向的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的聚磷酸酯混合膠束

由于藥物穿過血-腦屏障(BBB)的低效價，藥物輸送受到阻礙，藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤疾病的治療受到限制。轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)可以促進納米載體通過鐵蛋白受體(TFR)介導(dǎo)的途徑轉(zhuǎn)運作用。在這項研究中，TF-改性裝載紫杉醇聚磷酸酯混合膠粒(TPM)，制備并評價聚磷酸酯的混合膠束形成的核-殼結(jié)構(gòu)其在體外和體內(nèi)腦靶向的效率。在水溶液中，其表現(xiàn)出高的藥物截留效率(89.9 ±3.4)%此外，膠束顯示的溶血在2.0mg/mL可忽略不計。該TPM是(87.85±2.32)nm的電勢-12.33±1.46mV和聽PTX聽呈持續(xù)釋放TPM，TPM證實細(xì)胞攝取和腦積累增強。2和1.8倍PMT，PM表現(xiàn)最強的抗膠質(zhì)瘤活性，意味著小鼠顱內(nèi)U-87MG聽神經(jīng)膠質(zhì)瘤與TPM(39.5d)治療的生存期顯著長于單純紫杉醇(33.6d)處理。這些結(jié)果表明，與鐵蛋白綴合的膠束可以是一個有希望用于腦靶向藥物遞送的載體[9]。

1.5 載有阿霉素和紫杉醇的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的磁性二氧化硅納米粒子的PLGA

有效治療惡性腦膠質(zhì)瘤的藥物由穿過血 - 腦屏障(BBB)并穿過血液 - 腫瘤屏障(BTB)的低滲透差輸送而受到阻礙。在這項研究中，轉(zhuǎn)鐵蛋白綴合的磁性二氧化硅的PLGA納米顆粒(MNP-MSN-PLGA-鐵蛋白納米粒)配制來克服這些障礙。這些納米顆粒裝載有阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，在體外和體內(nèi)進行它們的抗增殖作用評價。在體外細(xì)胞毒性的實驗中，載藥納米顆粒作用U- 87細(xì)胞進行評價。通過磁場的存在和TF的使用，載藥納米顆粒隨細(xì)胞的攝取可以分別增強靶向配體，特別是，含DOX的PTX-NPS-Tf中，含DOX的PTX納米粒，含DOX的PTX-NPS-TF和自由鐵蛋白的治療。含DOX的PTX-NPS-TF和相比磁場處理的細(xì)胞表現(xiàn)出最高的細(xì)胞毒性;載藥納米顆粒的體內(nèi)治療效果進行了評價，在BALB/c裸鼠的顱內(nèi)種植U-87MG-luc2進行造模，實施動物實驗。相比含DOX的PTX-NPS-鐵蛋白治療表現(xiàn)最強的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤活性，PTX-NPS-Tf中，含DOX的NPS-鐵蛋白空白MNP-MSN-PLGA-鐵蛋白納米粒應(yīng)用后并沒有表現(xiàn)出急性毒性?？傮w而言，MNP-MSN-PLGA-鐵蛋白納米粒是有希望應(yīng)用于實踐，雙重藥物有效治療腦膠質(zhì)瘤的合適載體[10]。

1.6 聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-CO-PEG嵌段共聚物納米顆粒

紫杉醇納米粒子穿透血腦屏障可改善惡性膠質(zhì)瘤治療。在大多數(shù)癌癥，包括原發(fā)性腦腫瘤，由于腫瘤內(nèi)藥物分布差和藥物短的半衰期強烈限制化療藥療效。對于不能完全手術(shù)切除的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，通過控制聚合物局部的釋放或靶向藥物遞送是一種很有前途的方法來治療浸潤腦腫瘤。然而，藥物滲透與傳統(tǒng)療法局部有限的，因為小分子藥物往往進入他們遇到的最近的組織細(xì)胞，且其滲透作用只持續(xù)很短的距離。納米顆?？梢员苊馀c腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)粘附相互作用可以提高藥物分布和當(dāng)作用到腫瘤區(qū)域維持廣泛的藥物釋放。我們以前曾研究表明當(dāng)涂覆有異常致密層的聚(乙二醇)(PEG)，當(dāng)納米顆粒直徑達114納米時，聚苯乙烯納米顆粒模型能夠在正常的腦組織中迅速擴散，可以減少粘合劑的相互作用。這里，NanceE等人研究表明，攜載紫杉醇(PTX)平均直徑為70nm的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-CO-PEG嵌段共聚物納米顆粒比類似尺寸的攜載PTXPLGA顆粒(不含PEG)或未包封的PTX相比能夠有100倍的擴散速度，PEG化的加載PTX納米粒局部應(yīng)用到既定腦膠質(zhì)瘤時能顯著延遲腫瘤生長。結(jié)合載藥PLGA-PEG納米粒子增強分布于腫瘤浸潤面，延緩腫瘤生長，證明了腦腫瘤實質(zhì)內(nèi)納米粒子穿透力提高了，同時提高治療效果。使用載藥腦穿透納米顆粒是一種很有前途的方法來實現(xiàn)持續(xù)的和更均勻的藥物輸送到治療侵襲性膠質(zhì)瘤和潛在的其他腦部疾病。

現(xiàn)在用于納米藥物載體的材料主要是殼聚糖(CS)和磷脂(PE)的聚合物。殼聚糖具有生物降解性、生物相容性、生物粘附性和促滲透作用，對人體幾乎無毒副作用，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。此外，由于殼聚糖分子上具有活性氨基和羥基，為接枝反應(yīng)和離子相互作用提供了基礎(chǔ)，因此適合作為藥物控釋系統(tǒng)的載體材料 。磷脂酰乙醇胺在動物中是通過胞苷二磷酸乙醇胺和1，2-甘油二酯的反應(yīng)生成的，經(jīng)磷酯酶A的作用生成溶血磷脂酰乙醇胺。聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺納米膠束粒徑小、尺寸均一，作為藥物載體近年來也受到關(guān)注, 但其昂貴的價格使它的實際應(yīng)用受到限制。開發(fā)一種價格便宜、制備方法簡單的載體，為臨床應(yīng)用提供新的載體材料成為研究的重點。

納米藥物載體還可以根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面的受體連接相應(yīng)的化合物，使其具有對腫瘤的主動靶向作用。研究證實在納米粒子表面連接乳鐵蛋白(Lf)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和Angiopep肽、uPA激活細(xì)胞穿透肽(ACPP)等均能提高納米粒通過血腦屏障的能力，有較顯著的腦腫瘤靶向作用。此外，納米載藥系統(tǒng)還能夠進行熒光標(biāo)記。貴金屬納米團簇是新近發(fā)現(xiàn)的適合納米粒子的熒光標(biāo)記物，是由Au、Ag或Pt等貴金屬的幾個至幾十個原子組成的具有熒光水溶性的分子級聚集體，其特有的量子尺寸效應(yīng)使其熒光發(fā)射光譜在可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)可調(diào)諧。此外，貴金屬納米團簇具有生物相容性好、光穩(wěn)定性強且在所有相關(guān)時間尺度上無閃爍等特點，顯著提高現(xiàn)有分析方法的靈敏度。

大量的研究已經(jīng)證實納米材料作為有效載體能夠透過血腦屏障，其機制可能有以下幾方面：①通過在腦微血管壁上的長時間吸附，延長了抗腫瘤藥物在腦微血管處的作用時間；②其特定表面活性效應(yīng)致使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜的脂質(zhì)溶解度、細(xì)胞膜流動性增強了；③開放血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接；④能夠以胞飲的方式被血管內(nèi)皮細(xì)胞吞噬；⑤能夠直接穿越透過血管內(nèi)皮細(xì)胞層而進入腦組織；⑥表面修飾劑T-80抑制P-糖蛋白的作用。這些機制可能單獨或聯(lián)合發(fā)揮作用?；诩{米材料的這些優(yōu)勢，現(xiàn)在人們開始重視通過納米技術(shù)構(gòu)建載藥系統(tǒng)，將化療藥物或基因靶向到腦腫瘤，進而達到有效治療腫瘤的目的。

2 展望

目前，運用納米技術(shù)包載紫杉醇的納米載藥系統(tǒng)的構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)成熟。我們前期研究工作已經(jīng)可以通過乳化溶劑蒸發(fā)技術(shù)包載紫杉醇得到大小均勻的載藥納米粒子。盡管腫瘤靶向治療的納米載體近年來經(jīng)歷了爆發(fā)式的發(fā)展，迄今為止只有少數(shù)的幾種納米載體藥物能夠通過FDA的批準(zhǔn)進入市場，因為這些納米載體或多或少在潛在毒性、生物相容性、體內(nèi)穩(wěn)定性以及載藥能力等方面存在著嚴(yán)重的缺陷和挑戰(zhàn)。納米載體攜載紫衫醇進入腦內(nèi)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制如何，是否發(fā)生與外周神經(jīng)相同的作用？作用機制如何？這都有待于我們?nèi)ソ鉀Q。但我們還要在下面兩個方面進一步研究，一、如何將靶向配體、磷脂和熒光標(biāo)記的納米金簇結(jié)合，實現(xiàn)靶向腦腫瘤和靶向腫瘤微環(huán)境，又具有生物檢測的特點，降低生產(chǎn)成本，從而構(gòu)建一種更適合攜載紫杉醇的多功能納米載藥系統(tǒng)；二、從分子、細(xì)胞和動物水平深入研究其對海馬神經(jīng)元的毒性，利用基因芯片、2-DE等組學(xué)技術(shù)尋找與紫杉醇相互作用的關(guān)鍵靶蛋白，確定其結(jié)構(gòu)，運用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)技術(shù)分析其作用網(wǎng)絡(luò)，推測出紫杉醇調(diào)控海馬神經(jīng)元的分子機制，并將關(guān)鍵靶蛋白克隆并轉(zhuǎn)染至海馬神經(jīng)元加以驗證。為臨床應(yīng)用紫杉醇多功能納米粒子治療腦膠質(zhì)瘤時，合理用藥、降低毒副作用提供理論依據(jù)；為設(shè)計合成高效、多功能納米藥物提供理論支持和新的思路，同時我們還將為研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型納米藥物提供新的載體材料。

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李明軍(1965～)男 ，黑龍江鶴崗人，學(xué)士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

榮向輝(1976～)男 ，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生，副主任醫(yī)師。E-mail：171167108@qq.com。

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1008-0104(2015)03-0090-03

2014-12-07)