李 凱，吳正祥

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院消化內科，安徽 合肥230001

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一類胃腸道慢性免疫異常疾病，主要包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因及發(fā)病機制尚不明確，近年來，許多研究認為是基因易感性人群中體內腸道菌群和腸黏膜免疫應答平衡失調及腸上皮功能障礙所引起［1］。腸內穩(wěn)態(tài)失衡時，腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)發(fā)生內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，損傷腸黏膜，影響IBD 發(fā)生。

1 IECs 與ERS

1.1 IECs 特點 腸上皮在維持腸道穩(wěn)態(tài)方面起重要作用，其將共生菌群與宿主環(huán)境隔離開來，除了吸收營養(yǎng)物質外，IECs 能分泌多種激素和介質。小腸隱窩中的潘氏細胞為小腸干細胞分化提供微環(huán)境，并且分泌大量的抗菌肽物質，如溶解酵素、防御素、脂質運載蛋白等，這有利于宿主增強抗感染能力，同時參與共生菌群在腸道中定植［2］。腸上皮中的杯狀細胞主要分泌大量黏液素，形成了黏蛋白層，構成了完整的腸內屏障［3］。另外，IECs 通過分泌多種細胞因子和趨化因子形成黏膜免疫系統(tǒng)抵御腸道菌群和毒素的侵襲，維持腸內環(huán)境穩(wěn)定。黏液基因蛋白(MUC2)是杯狀細胞分泌的大分子物質，是構成腸道屏障的主要物質，有實驗發(fā)現(xiàn)［4］，MUC2-/-小鼠黏液屏障受損，腸道菌群直接同腸上皮接觸，侵入結腸隱窩，形成自發(fā)性結腸炎。因此，IECs 功能障礙或數(shù)量減少時，抗菌肽物質分泌減少，腸黏液屏障被破壞，這是引起IBD 的一個重要因素。

1.2 ERS ERS 是指由于各種原因引起細胞內質網(wǎng)生理功能紊亂，導致蛋白質不能正確折疊的一種病理過程。內質網(wǎng)是合成蛋白質及貯存Ca2+的主要場所，IECs 對環(huán)境因素改變特別敏感，當處于高度無氧環(huán)境，高分子運轉條件下，或暴露于微生物代謝產(chǎn)物和毒素等環(huán)境時，通過影響內質網(wǎng)中蛋白質加工、運輸及Ca2+轉運，使未折疊蛋白過度蓄積，而誘發(fā)ERS，導致細胞損傷［5］。

此時，機體為減輕ERS 引起的細胞損害，增強細胞對損傷的抵抗力，將啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。UPR 指各種原因引起錯誤折疊及未折疊蛋白質在內質網(wǎng)中積蓄，致使ERS 蛋白轉錄增加、其他蛋白翻譯減少、蛋白質降解增多的一種反應。UPR 能夠促使未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白正確折疊，從而維持IECs 生理功能正常。UPR 功能受損最終會影響潘氏細胞和杯狀細胞的分泌功能，破壞腸內穩(wěn)態(tài)平衡，產(chǎn)生IBD［6］。

UPR 的激活主要通過內質網(wǎng)腔內分子伴侶grp78和內質網(wǎng)上3 個跨膜感受蛋白感知ERS，分別為內質網(wǎng)跨膜激酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、蛋白激酶樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase related-like ER kinase，PERK)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)，及它們各自下游的轉錄因子XBP1、AFT4、AFT6［7］。生理狀態(tài)下，IRE1、PERK、ATF6 與grp78 結合處于無活性狀態(tài)。應激時，未折疊蛋白增多，grp78 解離后與未折疊蛋白結合，引起IRE1、PERK、ATF6 的活化及釋放。IRE1 在腸上皮中特異性表達，ERS 時，IRE1 通過激酶結構域啟動磷酸化，形成二聚體，并激活內切核糖核酸酶，將XBP1 的mRNA(Xbp1u)移碼剪接成為具有活性的Xbp1s，激活UPR［8］。同時，ERS 還激活調節(jié)性IRE1 依賴衰解(RIDD)作用，引起內質網(wǎng)相關mRNAs 選擇性降解，這有利于減少內質網(wǎng)的轉運負擔，減輕ERS［9］。ATF6是一種Ⅱ型跨膜蛋白，當發(fā)生蛋白錯誤折疊后，ATF6首先被高爾基體上的S1P和S2P 蛋白酶水解，釋放出胞質結構域中的ATF6f 或ATF6p50，它們能改變胞核的位置，從而激活UPR 靶基因，如grp78、grp94 和P58IPK［7］。PERK 屬于絲/蘇蛋白激酶，當產(chǎn)生內質網(wǎng)應激的時候，其通過絲氨酸磷酸化激活延長起始因子eIF2α，抑制內質網(wǎng)中蛋白質翻譯，減少內質網(wǎng)腔內蛋白質合成。與此同時，ERS 相關蛋白表達卻上調，這與應激蛋白mRNAs 基因上的某些特殊結構有關，如5-非編碼區(qū)的上游開放閱讀框架。這些特殊結構使應激相關蛋白逃避eIF2α 磷酸化后的合成抑制作用而得以優(yōu)先翻譯。ATF4 是上述過程的關鍵因子，它上調了eIF2α 磷酸化時應激蛋白mRNAs 的翻譯水平。另外，ATF4 還介導氨基酸轉運、抗氧化應激、谷胱甘肽的生物合成等過程［7］。

1.3 ERS 誘導的細胞凋亡 當ERS 過于劇烈，UPR不足以完全代償緩解細胞損害，為維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，UPR 將激活細胞凋亡信號通路，誘導細胞凋亡。細胞凋亡途徑主要包括:(1)PERK-eIF2α-ATF4 誘導的細胞凋亡蛋白CHOP 合成;(2)IRE1 招募腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)，與激酶凋亡信號調節(jié)激酶(ASK1)形成IRE1-TRAF2-ASK1 復合物，激活JNK 凋亡途徑;(3)Bax/Bcl2 促進內質網(wǎng)Ca2+釋放，協(xié)助細胞凋亡;(4)caspase 家族促凋亡作用，caspase 促凋亡機制尚不明確，可能是caspase-12 活化后進一步激活caspase-9、caspase-3、效應caspase 切割多ADP 聚合酶和其他細胞內底物，最終導致細胞凋亡［10-11］。細胞凋亡是ERS 過強時一種保護機制，其清除多余的受損細胞，有利于減少組織損傷。

2 ERS 與IBD 的發(fā)生

正常狀態(tài)下，XBP1 處于低豐度(豐度指基因在一個基因組中的數(shù)量)，這意味著XBP1 功能僅有微小變化時，IECs 也極易產(chǎn)生ERS。Kaser 等［12］發(fā)現(xiàn)，敲除IECs Xbp1 的小鼠發(fā)生了與人類IBD 相似的回腸炎。同時，Xbp1-/-小鼠IECs grp78 表達水平增加，表明發(fā)生了ERS。最終小鼠IECs 中成熟潘氏細胞數(shù)減少，殘余的潘氏細胞分泌抗菌肽物質不足，導致腸道抗菌功能受損。另一方面，杯狀細胞數(shù)量也減少近30%，引起腸道黏液屏障損害。XBP1 缺陷還使JNK 磷酸化和嗜酸性粒細胞趨化因子CXCL1 分泌過多，使IECs 對微生物或細胞因子敏感性增加而產(chǎn)生炎癥。通過病理活檢發(fā)現(xiàn)XBP1-/-小鼠存在隱窩缺陷，中性粒細胞和單核細胞浸潤及潰瘍形成更能加以證實ERS 與IBD相關。

在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導的小鼠結腸炎實驗中，野生型結腸炎小鼠發(fā)生ERS，grp78、ATF4、CHOP及XBP1 表 達 增 加［13］。與ATF6α+/-小 鼠 相 比，ATF6α-/-小鼠由于UPR 信號通路異常，使上皮細胞凋亡信號被激活，最終grp78、grp94 和P58IPK表達減少，細胞凋亡增加，表現(xiàn)出更嚴重的腸上皮黏膜損害。與同窩對照的野生型小鼠相比，P58IPK-/-小鼠grp78、IRE1 磷酸化、CHOP 水平上調，也出現(xiàn)更嚴重的黏膜損害，同時伴有杯狀細胞減少，炎癥浸潤更深。因此，UPR 對于IECs ERS 至關重要，其通路信號受損將加重結腸炎癥。

Heazlewood 等［14］用ENU 誘導兩株老鼠(Winnie株和Eeyore 株)產(chǎn)生自發(fā)性結腸炎，結果發(fā)現(xiàn)兩株老鼠的Muc2 基因均發(fā)生錯義突變。兩株老鼠的Muc2生物合成發(fā)生改變，Muc2 蛋白前體錯誤折疊并在內質網(wǎng)空泡內異常積聚，成熟Muc2 貯存減少，杯狀細胞分泌黏蛋白數(shù)目也明顯減少。這些超微結構和生物合成改變都說明發(fā)生了ERS。這更進一步證明錯誤折疊蛋白與ERS 及IBD 之間的緊密關系。

除動物模型外，在人體研究中也發(fā)現(xiàn)了ERS 與IBD 聯(lián)系的相關證據(jù)。有學者通過實驗指出活動期CD 患者腸上皮中grp78 表達和XBP1 剪接高于正常對照人群，認為這與IECs 表面的ATP 結合盒G2(ABCG2)轉運蛋白錯誤折疊后水平下調有關［15］。另外一項研究中，與健康對照比較，UC 患者的非炎癥結腸黏膜組織中XBP1 剪接、IRE1 活化大幅度增多，應激蛋白grp78、grp94 表達也均增多。結果表明，UC 的腸上皮中存在大量的ERS，其甚至可以發(fā)生于非炎癥組織，而健康對照組中卻未發(fā)現(xiàn)，說明ERS 可作為UC的一般特征［16］。

3 ERS 在IBD 中的基因學研究

基因相關研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)XBP1 基因座突變導致連鎖不平衡反應缺失與IBD 發(fā)生有關。在XBP1 基因深度測序實驗中，IBD 患者XBP1 基因座上SNP(指在基因組上單個核苷酸的變異)大約是健康對照組的3倍，并且非同義SNP(nsSNPs)幾乎只存在于IBD，健康對照組基本沒有。推斷XBP1 基因座是IBD 的風險位點，XBP1 基因突變增加IBD 易感性［12］。

前梯度同源蛋白2(AGR2)是一種二硫鍵異構酶，能促使內質網(wǎng)黏蛋白二硫鍵正確折疊。AGR2 基因變異造成蛋白錯誤折疊，引起ERS，黏蛋白合成減少，促進IBD 發(fā)生。IBD 患者中，AGR2 蛋白表達水平下調［17］。實驗發(fā)現(xiàn)，AGR2-/-小鼠腸上皮發(fā)生ERS，最終發(fā)展為以肉芽腫特點為主的回腸結腸炎，其大腸炎癥病理特征與人類IBD 相似［18］。

4 ERS 與固有免疫、上皮細胞自噬

固有免疫應答在IBD 發(fā)病機制中起重要作用。Richardson 等［19］在研究秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)固有免疫應答能誘導ERS 發(fā)生，XBP1 能夠保護機體避免免疫應答帶來的損害。腸道炎癥時，機體啟動固有免疫應答，腸上皮中炎癥細胞分泌多種炎癥因子，不同程度誘導或抑制ERS。IL-10 是IBD 時重要的抗炎癥因子，實驗表明，與野生型小鼠比較，IL-10-/-小鼠發(fā)生慢性腸道炎癥時，腸上皮中grp78 表達增多。認為IL-10 調節(jié)p38 信號通路抑制ATF6 轉錄，減緩ERS。相反，某些促炎癥因子如TNF-α 卻誘導ERS［20］。因此，炎癥因子與ERS 相互作用共同影響IBD 的發(fā)生。

自噬是細胞處于應激或感染時，細胞自我吞噬引起胞內組分分解代謝過程，其最主要特點就是自噬體形成，它能通過溶酶體機制來降解其所包裹的內容物。Cadwell 等［21］報道在CD 中，自噬體基因ATG16L1 純合子變異使潘氏細胞中形態(tài)異常的蛋白顆粒蓄積，導致蛋白顆粒分泌途徑受損和高水平的炎癥反應。這說明IECs 自噬過程能夠維持胃腸穩(wěn)態(tài)，減少IBD 易感性。

有研究認為，ERS 是自噬激活的因素，Ogata 等［22］發(fā)現(xiàn)，IRE1 缺陷的細胞或給予JNK 抑制劑的細胞中，ERS 誘導自噬受抑制，而PERK 缺陷的細胞或敲除ATF6 的細胞受到ERS 后仍發(fā)生自噬，表明IRE1-JNK通路是激活自噬過程的關鍵。另外，有證據(jù)表明CHOP、ATF4 能夠上調自噬基因的轉錄［23］。ATG7 是參與自噬體合成的一個重要蛋白，自噬受損時，ATG7蛋白受抑制，引起ERS，ATG7 表達恢復后，ERS 減輕［24］。推測自噬與ERS 具有協(xié)同作用，UPR 時，自噬可以作為內質網(wǎng)相關蛋白降解過程的補充。自噬功能受損使IECs 對ERS 易感性增加，影響IBD 發(fā)生。

5 ERS 與IBD 的治療

由于IECs 極易受ERS 的影響，導致腸內炎癥，因此，若能通過減輕ERS 和改善UPR 功能來修復腸上皮功能，恢復腸內穩(wěn)態(tài)，這有可能為IBD 治療提供新的方向。Cao 等［13］在實驗模型中對小分子伴侶物質?；侨バ軜幽懰?TUDCA)和4-丁酸苯酯(PBA)的功能進行研究，分別給予Atf6α-/-、P58IPK-/-、野生型3株結腸炎小鼠口服TUDCA 或PBA 其中一種，結果發(fā)現(xiàn)3 株老鼠IECs 中ERS 減輕，炎癥均明顯緩解，最后實驗人員將結果與接受吡羅昔康來誘導緩解的IL-10-/-小鼠作對照，發(fā)現(xiàn)治療效果基本相同。這些數(shù)據(jù)指出，小分子伴侶促進內質網(wǎng)中的蛋白質正確折疊，減輕ERS，由此來緩解實驗誘導的腸內炎癥。

谷氨酰胺是人體非必需氨基酸，有人用谷氨酰胺治療三硝基苯磺酸誘導的結腸炎小鼠后，小鼠結腸炎癥減輕，ERS 標記物ATF6、ATF4、CHOP 表達下調，IRE1 磷酸化水平和XBP1 剪接也減少，表明谷氨酰胺能抑制ERS 和細胞凋亡［25］。目前對ERS 在IBD 中研究尚少，也沒有ERS 相關藥物用于IBD 臨床治療，因此，通過調控ERS 及UPR 通路治療IBD 具有廣泛的應用前景。

多個動物模型實驗、人體研究及基因研究表明［12-18］，ERS 在維持胃腸穩(wěn)態(tài)過程中具有重要意義。當ERS 過于劇烈或UPR 功能障礙時，將激活細胞凋亡途徑，引起IECs 數(shù)目減少和功能障礙，損害腸黏膜，是人類IBD 炎癥的重要原因。機體固有免疫、自噬過程與ERS 共同作用，影響IBD 發(fā)生。ERS 相關炎癥機制不僅有助于理解IBD 發(fā)病基礎，也為將來治療IBD提供有效方法。

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