向德森，張 敬，肖 杰，冉文華，黃自鐸，周 濤

（重慶市黔江中心醫(yī)院普外科 409000）

已有前瞻性研究顯示，循環(huán)脂聯(lián)素水平與結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。美國(guó)的護(hù)士健康研究（NHS）和衛(wèi)生專業(yè)人員隨訪研究（HPFS）等兩個(gè)大型的前瞻性隊(duì)列研究結(jié)果表明，僅在男性人群中觀察到低水平脂聯(lián)素與CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在聯(lián)系［1］。然而，觀察性研究存在固有的局限性，如無法很好地控制混雜因素，難以建立暴露因素與疾病發(fā)生之間的因果關(guān)系。而利用個(gè)體遺傳變異可能會(huì)影響循環(huán)中的脂聯(lián)素水平，從而可為脂聯(lián)素與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)提供因果證據(jù)。在配子形成過程中，等位基因的分配是獨(dú)立的，即類似于干預(yù)試驗(yàn)的隨機(jī)化。此等位基因的分配可確保遺傳變異與疾病結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)無法被其他常見混雜因素打破。

此前的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已鑒定出幾個(gè)可影響血循環(huán)脂聯(lián)素水平的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)［2－3］。已有研究表明，脂聯(lián)素及其受體基因的多態(tài)性會(huì)影響血循環(huán)脂聯(lián)素水平，但國(guó)內(nèi)鮮少有關(guān)于脂聯(lián)素基因多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究報(bào)道。本研究對(duì)本院CRC患者行脂聯(lián)素3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用病例對(duì)照研究，研究對(duì)象來源于2010年1月至2014年1月在本院診治或健康查體者。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：病理組織學(xué)確診為原發(fā)CRC、無合并其他腫瘤，在行放射化學(xué)治療前，以同意抽取10mL血液進(jìn)行遺傳學(xué)檢查者納入；排除標(biāo)準(zhǔn)：合并2項(xiàng)或以上腫瘤、CRC為轉(zhuǎn)移癌、有糖尿病病史或已接受放射化學(xué)治療者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無惡性腫瘤病史、無糖尿病病史，來本院行健康體檢，且同意抽取10 mL血液進(jìn)行遺傳學(xué)檢查者。對(duì)照組的性別及年齡（±5歲）與病例組匹配。納入病例、對(duì)照各250例，其中病例組患者43～68歲，平均（55.8±8.0）歲；對(duì)照組患者46～69歲，平均（55.5±7.8）歲。

1.2 方法

表1 基因多態(tài)位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)

表2 基因多態(tài)位點(diǎn)探針設(shè)計(jì)

1.2.1 試劑與設(shè)備 Taqman熒光定量PCR儀ABI7900；脂聯(lián)素基因的3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)：脂聯(lián)素5′端側(cè)翼區(qū)－11377C/G位點(diǎn)：rs266729，外顯子2區(qū)＋45T/G位點(diǎn)：rs2241766，以及內(nèi)含子2區(qū)＋276G/T位點(diǎn)：rs1501299。使用VIC及FAM標(biāo)記探針。此3個(gè)位點(diǎn)的引物由美國(guó)ABI公司合成，PCR試劑及引物均購自美國(guó)ABI公司，DNA提取試劑盒購自德國(guó)Qiagen公司。反應(yīng)所用的基因多態(tài)位點(diǎn)引物信息見表1，探針信息見表2。

1.2.2 樣本DNA提取及脂聯(lián)素基因分型 抽取研究對(duì)象外周血，利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)rs266729、rs2241766和rs1501299的基因多態(tài)性。每個(gè)反應(yīng)體系總體積5.0μL，包含DNA模板（濃度為30～100ng/μL）1.0μL，2×Taqman通用 MasterMix 2.5μL，每條引物濃度為225nmol/L，每條探針濃度為50nmol/L。反應(yīng)條件為55℃2min，95℃10min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（90℃30s，60℃1min）。在測(cè)量等位基因特異性熒光后，用SDS軟件分析基因型別。為確?；蚍中偷臏?zhǔn)確性，隨機(jī)重復(fù)10.0%的樣品，結(jié)果一致性符合率為100.0%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)基因型頻率和等位基因頻率?；蛐蛣e、基因－基因、基因－環(huán)境交互作用采用Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般人口學(xué)特征 兩組對(duì)象性別相匹配，病例組、對(duì)照組各納入女48例，男202例。兩組間在年齡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.37，P＝0.714）。病例組的體質(zhì)量指數(shù)（BMI）較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.68，P＝0.000），見表3。病例組有腫瘤家族史25例，對(duì)照組有腫瘤家族史8例，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝9.38，P＝0.002）。

表3 研究對(duì)象人口學(xué)特征（±s）

表3 研究對(duì)象人口學(xué)特征（±s）

變量 病例組 對(duì)照組t P年齡（歲）≥60 64.35±2.78 64.23±2.66 0.31 0.401＜60 49.37±3.30 49.44±3.11 0.18 0.524 BMI（kg/m2）24.24±2.57 23.61±2.42 4.68 0.000

2.2 脂聯(lián)素3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn) 脂聯(lián)素－11377C/G位點(diǎn)（rs266729）病例組突變型（GG）及G等位基因攜帶者（CG、CG＋GG）均高于對(duì)照組（P＝0.047、0.016、0.007）。對(duì)于脂聯(lián)素＋45T/G位點(diǎn)（rs2241766），病例組的 G等位基因攜帶者（TG、TG＋GG）高于對(duì)照組（P＝0.046、0.040）。對(duì)于脂聯(lián)素＋276G/T位點(diǎn)（rs1501299），病例組T等位基因攜帶者（TG、TG＋TT）低于對(duì)照組（P＝0.011、0.007），見表4。

表4 脂聯(lián)素基因多態(tài)性與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

2.3 脂聯(lián)素基因－基因交互作用與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 條件Logistic回歸分析顯示，脂聯(lián)素的3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)間不存在基因－基因交互作用，見表5。

2.4 脂聯(lián)素基因－環(huán)境交互作用與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 惡性腫瘤家族史與BMI之間的交互作用并未影響CRC的發(fā)生（OR＝0.96，P＝0.793）。進(jìn)一步利用Logistic回歸分析脂聯(lián)素的3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)分別與BMI、腫瘤家族史之間進(jìn)行交互作用，結(jié)果顯示，僅有脂聯(lián)素5′端側(cè)翼區(qū)－11377C/G位點(diǎn)rs266729與BMI之間存在交互作用，表明兩者相互作用促使CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高（OR＝1.16，P＝0.012），見表6。

表5 Logistic回歸分析脂聯(lián)素基因－基因交互作用與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

表6 Logistic回歸分析脂聯(lián)素基因－環(huán)境交互作用與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

3 討 論

CRC是癌癥發(fā)病和死亡順位中位居前列的惡性腫瘤，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年大概有133.0萬CRC新發(fā)病例，60.8萬死亡病例［4］。我國(guó)是CRC高發(fā)的國(guó)家之一。CRC占我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病的第3位，是惡性腫瘤死亡順位第5位，給國(guó)家和人民帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)［5］。

肥胖、中心型肥胖及能量攝入增加，均可使CRC的發(fā)病率增高［6］。他們通過作用于胰島素水平、胰島素抵抗及炎性反應(yīng)引起致癌效應(yīng)。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的因子，它是胰島素的增敏劑，并與已知CRC風(fēng)險(xiǎn)因素即肥胖、2型糖尿病及炎癥相關(guān)聯(lián)［7－9］。對(duì)血漿脂聯(lián)素水平與CRC關(guān)聯(lián)的研究得到了相矛盾的結(jié)果。Wei等［10］觀察到低脂聯(lián)素水平與男性CRC風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，而另外一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)兩者并無關(guān)聯(lián)［11］。有研究認(rèn)為，脂聯(lián)素基因的遺傳變異有可能是導(dǎo)致這些矛盾結(jié)果的原因之一。研究人員已找到幾個(gè)影響脂聯(lián)素水平的基因變異位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病相關(guān)［12］。

本病例對(duì)照研究中，選擇了與胰島素抵抗相關(guān)的脂聯(lián)素的3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，分別是位于5′端側(cè)翼區(qū)－11377C/G位點(diǎn)：rs266729、外顯子2區(qū)＋45T/G位點(diǎn)：rs2241766，以及內(nèi)含子2區(qū)＋276G/T位點(diǎn)：rs1501299。本研究結(jié)果表明，個(gè)體攜帶rs266729的突變純合子GG及G等位基因（GT＋GG）均可增加CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［OR（95%CI）：1.87（1.01～3.47）、1.63（1.14～2.32）］。同樣現(xiàn)象在rs2241766位點(diǎn)亦被觀察到。個(gè)體攜帶G等位基因（TG＋GG）者發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)是健康人群的1.45倍（95%CI：1.02～2.06）。

脂聯(lián)素基因位于染色體3q27處，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，大概跨越了17kb區(qū)域。已鑒定出該基因是代謝綜合征及2型糖尿病的敏感位點(diǎn)，其中包括了rs266729及rs2241766。已有幾個(gè)研究證實(shí)，脂聯(lián)素上述2個(gè)位點(diǎn)變異可引起循環(huán)脂聯(lián)素水平下降，胰島素抵抗上升，并與CRC的致癌因素之一即2型糖尿病有關(guān)［13］。脂聯(lián)素是脂肪來源的蛋白質(zhì)，在血清中大量存在。與其他脂肪因子不同，脂聯(lián)素與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗呈反向相關(guān)關(guān)系。脂聯(lián)素亦是一種已知的胰島素增敏激素，它能在葡萄糖代謝中起放大胰島素的作用。因而，對(duì)于rs266729的野生型GG位點(diǎn)，其G等位基因（CG＋GG）及rs2241766野生型TT位點(diǎn)，攜帶TG＋GG基因型別均可能與低脂聯(lián)素水平、高的胰島素抵抗及CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。本研究與脂聯(lián)素的生物學(xué)效應(yīng)較吻合。最新研究表明，脂聯(lián)素及其受體基因在癌癥形成，尤其是導(dǎo)致與肥胖相關(guān)的癌癥中起著關(guān)鍵的作用。有研究表明，脂聯(lián)素基因通過調(diào)節(jié)癌變重要通路：AMPK或β－連接素－Wnt信號(hào)通路來執(zhí)行其功能［14］。

肥胖導(dǎo)致癌癥的不同致病機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。Wei等［10］認(rèn)為，肥胖誘導(dǎo)胰島素抵抗即高胰島素血癥，從而致使血循環(huán)胰島素水平增高。此過程正向?qū)е翪RC的發(fā)生。最近有研究表明，肥胖者的BMI升高與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)關(guān)系，且與性別、腫瘤發(fā)生部位有關(guān)［15－16］。本研究表明，病例組較對(duì)照組有著更高的BMI（t＝4.68，P＝0.000）。肥胖誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)是脂肪組織功能受損的重要特征，它被認(rèn)為在肥胖致癌過程中起著關(guān)鍵的作用。

盡管CRC的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，許多研究表明，CRC的發(fā)生、發(fā)展是環(huán)境－基因共同作用的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)飲食習(xí)慣西化，如大量攝入紅肉、長(zhǎng)時(shí)間靜坐以及不運(yùn)動(dòng)等在CRC的發(fā)病過程中起著重要的作用。與健康人群不同，有肥胖、2型糖尿病的人群CRC的發(fā)病率及病死率更高，是由于糖尿病及肥胖均可導(dǎo)致胰島素抵抗有關(guān)［17－18］。本研究結(jié)果表明，rs266729與BMI之間存在交互作用，表明兩者相互作用促使CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高［OR95%CI：1.16（1.03～1.30）］。

本研究?jī)H分析了脂聯(lián)素的3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，及其與BMI、腫瘤家族史之間的交互作用對(duì)CRC發(fā)病的影響，尚未能分析與胰島素抵抗、糖尿病發(fā)病的血清學(xué)因子，這些有待課題組今后的研究進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Song M，Zhang X，Wu K，et al.Plasma adiponectin and soluble leptin receptor and risk of colorectal cancer：a prospective study［J］.Cancer Prev Res（Phila），2013，6（9）：875－885.

［2］Dastani Z，Hivert MF，Timpson N，et al.Novel loci for adiponectin levels and their influence on type 2diabetes and metabolic traits：a multi－ethnic meta－analysis of 45 891in－dividuals［J］.PLoS Genet，2012，8（3）：e1002607.

［3］Wu Y，Li Y，Lange EM，et al.Genome－wide association study for adiponectin levels in Filipino women identifies CDH13and a novel uncommon haplotype at KNG1－ADIPOQ［J］.Hum Mol Genet，2010，19（24）：4955－4964.

［4］Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008：Globocan 2008［J］.Int J Cancer，2010，127（12）：2893－2917.

［5］陳萬青，張思維，鄭榮壽，等.中國(guó)腫瘤登記地區(qū)2007年腫瘤發(fā)病和死亡分析［J］.中國(guó)腫瘤，2011，20（3）：162－169.

［6］Macinnis RJ，English DR，Hopper JL，et al.Body size and composition and colon cancer risk in men［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13（4）：553－559.

［7］Filippi E，Sentinelli F，Trischitta V，et al.Association of the human adiponectin gene and insulin resistance［J］.Eur J Hum Genet，2004，12（3）：199－205.

［8］Kaklamani VG，Wisinski KB，Sadim M，et al.Variants of the adiponectin（ADIPOQ）and adiponectin receptor 1（ADIPOR1）genes and colorectal cancer risk［J］.JAMA，2008，300（13）：1523－1531.

［9］Joshi RK，Kim WJ，Lee SA.Association between obesityrelated adipokines and colorectal cancer：a case－control study and meta－analysis［J］.World J Gastroenterol，2014，20（24）：7941－7949.

［10］Wei EK，Giovannucci E，F(xiàn)uchs CS，et al.Low plasma adiponectin levels and risk of colorectal cancer in men：aprospective study［J］.J Natl Cancer Inst，2005，97（22）：1688－1694.

［11］Lukanova A，Soderberg S，Kaaks R，et al.Serum adipone－ctin is not associated with risk of colorectal cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，15（2）：401－402.

［12］Beltcheva O，Boyadzhieva M，Angelova O，et al.The rs266729 single－nucleotide polymorphism in the adiponectin gene shows association with gestational diabetes［J］.Arch Gynecol Obstet，2014，289（4）：743－748.

［13］Chu HY，Wang ML，Zhong DY，et al.AdipoQ polymorphisms are associated with type 2diabetes mellitus：a meta－analysis study［J］.Diabetes Metab Res Rev，2013，29（7）：532－545.

［14］Dieudonne MN，Bussiere M，Dos Santos E，et al.Adiponectin mediates antiproliferative and apoptotic responses in human MCF7breast cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，345（1）：271－279.

［15］Ashktorab H，Paydar M，Yazdi S，et al.BMI and the risk of colorectal adenoma in African－Americans［J］.Obesity（Silver Spring），2014，22（5）：1387－1391.

［16］Rickles AS，Iannuzzi JC，Mironov O，et al.Visceral obesity and colorectal cancer：are we missing the boat with BMI？［J］.J Gastrointest Surg，2013，17（1）：133－143.

［17］Basen－Engquist K，Chang M.Obesity and cancer risk：recent review and evidence［J］.Curr Oncol Rep，2011，13（1）：71－76.

［18］Noto H，Tsujimoto T，Sasazuki T，et al.Significantly increased risk of cancer in patients with diabetes mellitus：a systematic review and meta－analysis［J］.Endocr Pract，2011，17（4）：616－628.