唐政恒，高詩豪，陳圖南，李 飛，陳冬藝，單佑安，馮 華，程 遠(yuǎn)

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科 400038）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是多病因致腦底或腦及脊髓表面血管破裂的急性出血性腦血管病，約占急性腦卒中的10.0%，占出血性腦卒中的20.0%。SAH常采取控制血壓、減輕水腫及止血予以治療，目前多選用以尼莫地平為代表的鈣拮抗劑進(jìn)行治療，尼莫地平脂溶性強，能透過血－腦屏障，有效改善血腫周圍腦血流量并減輕腦水腫，進(jìn)而減輕對周圍腦組織的壓迫，減少神經(jīng)細(xì)胞的損害［1－2］。近年研究顯示，補體系統(tǒng)過度活化在SAH發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用，但目前臨床上尚缺乏有效的補體抑制性藥物。

草麻黃在我國分布廣，是中藥方劑的常用藥［3］，對急性腎炎、支氣管哮喘、免疫炎性反應(yīng)相關(guān)疾病等有較顯著的療效，有研究認(rèn)為，抑制補體活化介導(dǎo)的炎性及免疫反應(yīng)是草麻黃發(fā)揮治療作用的根本機(jī)制［4］。補體激活成分C3a是一種重要的炎性介質(zhì)，在感染、創(chuàng)傷、缺血再灌注損傷、自身免疫疾病等多種原因引起的急、慢性炎性反應(yīng)中，介導(dǎo)了對自身組織細(xì)胞的病理性損傷。而炎性及免疫反應(yīng)，尤其補體活化介導(dǎo)的炎性及免疫反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的預(yù)后起重要的作用［5］。因此，用補體抑制劑阻斷補體活化可成為治療炎癥的一種有效手段，楊康等［6］證實草麻黃水提物中堿沉淀物在體外具有良好的補體抑制活性。故本研究采用草麻黃水提物灌胃SAH大鼠，觀察其對SAH的治療效果，為SAH治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 草麻黃水提物的制備 草麻黃水提物制備主要參考Ling等［7］的方法進(jìn)行。具體方法：1kg草麻黃加入10L蒸餾水（pH 4.0），60℃過夜后煮沸1h，過濾除渣，NaOH 調(diào)其pH值至9.0并出現(xiàn)大量沉淀，離心棄上清液，無水乙醇洗滌沉淀3次，60℃烘干得棕褐色粗品18.500g。將粗品溶于300mL蒸餾水（pH 4.0），磁力攪拌1h，離心棄沉淀，再用 NaOH 調(diào)其pH值至9.0，離心棄上清液。上述酸溶堿沉過程重復(fù)3次，最后得水提物2.375g，得率為12.8%（粗品計算），使用前將堿沉淀物溶于蒸餾水中，調(diào)pH值至4.0。

1.2 動物分組與SAH模型制備 SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量200.00～250.00g，2～3個月齡，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供，雌雄各半，隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、對照組和3個不同濃度（4、12、36mg/kg的草麻黃水提物）治療組，每組10只。以一尼龍線（Φ0.235mm）自頸外動脈導(dǎo)入，經(jīng)頸總動脈達(dá)頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段穿刺其分叉處，以此建立SAH模型。手術(shù)顯微鏡下，將一尼龍線（Φ0.235 mm）自頸外動脈導(dǎo)入，經(jīng)頸總動脈達(dá)頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段穿刺其分叉處，以此建立大鼠SAH模型［8］，并可通過局部腦血流量監(jiān)測判斷模型是否成功［9］。建模12h后，治療組以4、12、36 mg/kg的草麻黃水提物分別灌胃，對照組僅剝離各動脈管作假手術(shù)對照，對照組及模型組僅以等量生理鹽水灌胃治療。隨時觀察各組動物的活動、進(jìn)食、大小便等狀況。

1.3 檢測指標(biāo) 3d后斷頭處死各組實驗大鼠，解剖大鼠腦組織，大體觀察其損傷、出血等情況。采用干濕法檢測腦組織含水量，并制作10.0%組織勻漿，離心取上清液進(jìn)行谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）、丙二醛（MDA）、羥自由基等檢測，嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行。HE染色：取海馬組織，制成常規(guī)病理石蠟切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組病變情況。免疫組織化學(xué)觀察：用抗補體C3鼠抗人單克隆抗體（Santa Cruze，sc－28294，1∶200）配合即用型檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SP－9002）對補體C3抗原染色，DAB顯色并拍照。提取總蛋白：取大鼠海馬組織，剪碎后加RIPA裂解液（碧云天，P0013B）。冰浴中勻漿，離心取上清液，測蛋白濃度后分裝，置－80℃保存?zhèn)溆?。蛋白水平測定按BSA法，以牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。Western blot檢測：50μg/孔蛋白樣品經(jīng)6.0%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離后，13V（恒壓）過夜，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以含5.0%脫脂奶粉的TBST（100 mmol Tris，0.9%NaCl，pH 7.5）室溫封閉2h，抗補體C3鼠抗人單克隆抗體（Santa Cruze，sc－28294，1∶200）室溫反應(yīng)2h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶1 000倍稀釋）室溫反應(yīng)2h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后大鼠一般情況和大體觀察 術(shù)后正常飼養(yǎng)，除對照組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)進(jìn)食減少，精神萎靡，活動緩慢及個別鼠大小便失禁等。術(shù)后3d內(nèi)，除36mg/kg治療組與對照組大鼠無死亡外，其余各組均死亡1只。除對照組外，其余各組均見明顯SAH，大量彌散性出血及血凝塊，主要分布于前、后顱窩處，包繞腦底部血管，穿刺側(cè)出血量相對較多。

2.2 腦組織含水量 腦組織觀察可見SAH損傷腦組織較對照組明顯水腫，體積增大，模型組腦含水量顯著高于對照組（P＜0.01）；草麻黃水提物12mg/kg及36mg/kg治療組腦組織含水量較模型組有明顯降低（P＜0.05），4mg/kg治療組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），且腦含水量隨著用藥劑量增加呈下降趨勢。見表1。

圖1 草麻黃水提物治療SAH的病理觀察（×100）

2.3 生化指標(biāo)檢測 SAH后3d，各組實驗大鼠腦組織勻漿生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，對照組顯著降低（P＜0.01），草麻黃水提物12、36mg/kg治療組 MDA水平、GSHPx酶活力與羥自由基能力顯著降低（P＜0.01）；草麻黃水提物4mg/kg治療組的MDA水平變化不明顯，GSH－Px酶活力與抑制羥自由基能力顯著降低（P＜0.05），見表2。

2.4 HE染色觀察病理情況 術(shù)后3dHE染色顯示，模型組腦組織海馬CA1區(qū)呈現(xiàn)明顯充血、水腫，部分細(xì)胞腫脹、皺縮，細(xì)胞周間隙增大。對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，核仁及尼氏體清楚。而草麻黃水提物治療后，充血與水腫均有不同程度的緩解（圖1），且隨藥物劑量的增加其充血、水腫改善越明顯。

2.5 免疫組織化學(xué)檢測補體C3表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，各組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)均見補體C3表達(dá)，其中對照組表達(dá)很弱，SAH模型組的表達(dá)最強，草麻黃水提物治療組C3表達(dá)較模型組均有降低，提示草麻黃水提物對補體活化具明顯抑制作用。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測草麻黃水提物治療SAH后補體C3表達(dá)情況（×100）

表1 各組大鼠腦組織含水量的比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織含水量的比較（±s）

a：P＞0.05，b：P＞0.01，與模型組比較。

組別 n 腦組織含水量（%）對照組 5 76.58±0.72a模型組 5 83.25±0.34 4mg/kg治療組 5 82.76±1.02 12mg/kg治療組 5 80.01±1.25b 36mg/kg治療組 5 79.64±2.07b

表2 各組大鼠腦組織生化指標(biāo)檢測（±s）

表2 各組大鼠腦組織生化指標(biāo)檢測（±s）

a：P＜0.01，b：P＜0.05，與模型組比較。

組別 n MDA（mmol/L）GSH－Px（U/mL）羥自由基能力（U/mL）對照組 5 5.44±1.95a194.52±2.76a10.82±4.25a模型組 5 32.30±1.72 559.74±7.39 83.02±1.09 4mg/kg治療組 5 28.10±9.94 408.46±6.22b 48.54±2.31b 12mg/kg治療組 5 15.71±5.81a398.78±11.20a21.35±11.49a 36mg/kg治療組 5 11.10±3.09a297.01±1.65a20.25±10.82a

2.6 Western blot法檢測補體C3表達(dá)情況 術(shù)后3dWestern blot檢測結(jié)果表明，各組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)均有補體C3表達(dá)，其中對照組表達(dá)最弱，模型組表達(dá)最強，治療組居中，且36mg/kg治療組與模型組相比明顯降低，4mg/kg與12 mg/kg治療組與模型組相比變化不明顯，進(jìn)一步證實了草麻黃水提物對補體活化具有明顯抑制作用。見圖3。

圖3 Western blot檢測草麻黃水提物治療SAH后補體C3表達(dá)情況

3 討 論

Ling等［7］從草麻黃中純化出一種單體成分（CIC），并初步鑒定為高分子碳水化合物，不溶于堿溶于酸，證實該成分在體外具有良好的補體抑制活性。Ling等［7］在體外實驗中提出，CIC通過結(jié)合補體蛋白C2的活性部位，從而抑制補體激活的經(jīng)典途徑，且該結(jié)合是不可逆的；其次，CIC抑制補體蛋白C9的活化，并抑制終末途徑激活補體；但對替代途徑激活補體的抑制機(jī)制尚不清楚，很有可能是通過抑制B因子的活性發(fā)揮作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是存在補體系統(tǒng)激活的必要條件。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者腦組織存在自由基代謝紊亂，細(xì)胞膜磷脂中多聚不飽和脂肪酸的不飽和雙鍵受自由基的攻擊，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成一系列的脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物如MDA等。因此，大量氧自由基的產(chǎn)生及其誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［8－10］。GSH作為一種體內(nèi)自由基清除劑與GSH－Px結(jié)合，參與自由基和脂質(zhì)過氧化物損傷的防護(hù)，在腦損傷抗氧化防御中發(fā)揮作用［11－12］。本研究生化指標(biāo)檢測結(jié)果說明，經(jīng)草麻黃水提物治療后，與模型組相比，治療組腦組織中MDA、GSH－Px與羥自由基水平均顯著降低。提示草麻黃水提物在SAH的抗脂質(zhì)過氧化損傷中可能起重要作用。

補體系統(tǒng)的重要固有成分C3，是補體活化后的主要片段，處于3個途徑的匯合點，在補體系統(tǒng)激活過程中起著樞紐作用［13］。本研究將草麻黃水提物用于治療大鼠SAH，免疫組織化學(xué)與Western blot結(jié)果顯示，在對照組、草麻黃水提物治療組及模型組的腦組織中均有重要補體固有成分C3的表達(dá)，但對照組中表達(dá)很弱，且草麻黃水提物治療組的C3表達(dá)明顯低于模型組，提示草麻黃水提物可能抑制補體系統(tǒng)的激活。常規(guī)病理觀察及腦組織含水量顯示，草麻黃水提物治療后，SAH與水腫均得到不同程度的緩解，且從切片上可以觀察到出血與水腫隨劑量的增加改善越明顯。

綜上所述，草麻黃水提物能顯著抑制補體C3活性，阻止腦組織MDA、GSH－Px、羥自由基的產(chǎn)生，降低腦水腫的嚴(yán)重程度，從而減輕炎性反應(yīng)，對SAH動物具有較好的治療效應(yīng)。

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