劉博奇 ，陳善真，李中圣，羅 均，陳克宏，王貴平，李其昌

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東 廣州511400 ；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東 廣州 510642）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine Circovirustype 2，PCV-2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原，其感染后破壞動物機體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致其嚴(yán)重的免疫抑制，進而誘發(fā)多種混合感染和繼發(fā)感染，嚴(yán)重影響疾病的診斷和治療，已成為世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。大量的行業(yè)養(yǎng)殖現(xiàn)狀和試驗研究表明，疫苗注射是控制圓環(huán)病毒2 型感染的有效手段，因此國內(nèi)外學(xué)者針對該病的疫苗研制展開了大量研究，并取得了顯著成果。目前市售的PCV-2 商品化疫苗主要為滅活疫苗及亞單位疫苗，這兩種疫苗的上市對我國防控PCV-2 感染發(fā)揮了重大作用，其優(yōu)點是性能穩(wěn)定、使用安全、易保存等，但同時也存在疫苗生產(chǎn)成本高、病毒難以培養(yǎng)等困難。由于PCV-2 疫苗在傳統(tǒng)制備方法上尚存在缺陷，因此開發(fā)高效低廉的新型疫苗也逐漸被關(guān)注。近年來，越來越多的學(xué)者將注意力轉(zhuǎn)移至亞單位和多肽疫苗的研究，多肽抗原作為完整病毒蛋白的一部分，其不具備傳染疾病的危險性，并且可以大量合成生產(chǎn)，因此已成為疫苗研究開發(fā)的重要內(nèi)容之一。

本試驗根據(jù)已研發(fā)的非蛋白多糖多聚體定位耦聯(lián)PCV-2 B、T 細胞免疫活性表位多肽作為抗原，免疫實驗動物，取得了較好的免疫保護效果。同時該技術(shù)也可為其他獸用抗病毒生物制品的研發(fā)提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動物 體液病毒核酸少量提取試劑盒為美國愛思進產(chǎn)品；多肽由上海強耀生物科技有限公司合成；市售圓環(huán)病毒2 型疫苗為德國勃林格產(chǎn)品；免疫佐劑為廣州鼎國生物制劑產(chǎn)品；豬圓環(huán)病毒2 型抗體ELISA檢測試劑盒，購自武漢科前動物生物制品公司；35 日齡仔豬20 頭，購自廣東某豬場育種管理中心；豬圓環(huán)病毒2 型由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院張桂紅教授饋贈。

1.2 耦聯(lián)多肽疫苗的制備與鑒定 通過化學(xué)合成技術(shù)制備幾段含有抗原表位的多肽，序列及出處分別為：PSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSN（Cap 65-87）、QGDRGVGSTAVILDDNFVTKANALTYDPY VNYSS（Cap113-146）、SRYFTPKPVLDRTIDYFQPN NKRNQL（Cap158-183）、DHVGLGTAFENSKY（Cap 194-207）。用本項目組發(fā)明的非蛋白多聚體定位耦聯(lián)B、T 細胞免疫活性表位多肽技術(shù)，制備圓環(huán)病毒2 型多肽疫苗。

1.3 試驗動物分組及免疫程序 試驗分為4 個組，分別為耦聯(lián)多肽疫苗免疫組、市售疫苗免疫對照組、免疫佐劑對照組和空白對照組，每組5 頭仔豬。耦聯(lián)多肽疫苗組和免疫佐劑對照組的免疫劑量為2.0 mL/頭，市售疫苗組的免疫劑量為1.0 mL/頭，空白對照組不免疫。肌肉注射，分3 次免疫，首免（d1），二免（d8）和末次免疫（d23）。

1.4 血清特異性抗體檢測 分別于首次免疫前（d0）、免疫后每周（d8、d15、d22、d29、d36）抽取血液1 次，用ELISA方法進行抗體檢測，觀察抗體產(chǎn)生情況，當(dāng)抗體滴度趨于平穩(wěn)時進行攻毒試驗。

1.5 攻毒試驗 于攻毒前3 天（d38）對試驗動物進行免疫刺激。方法：每頭豬兩側(cè)腋下及臀部肌肉注射1 mL經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化的KLH（0.5 mg/mL）、腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基1.0 mL/頭。攻毒（d41）：圓環(huán)病毒培養(yǎng)液（106TCDI50）滴鼻1.0 mL/頭并肌肉注射2.0 mL/頭。攻毒后第4 天（d44）同d38 天方法進行免疫刺激處理。在攻毒后第11 天（d51）和第19天（d59），所有豬腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基1.0 mL/頭。若攻毒后出現(xiàn)瀕死或死亡的豬，及時剖檢觀察其肺、腹股溝及腸系膜淋巴結(jié)變化，并分離肺臟及淋巴結(jié)，分別冰凍保存和4%中性福爾馬林固定液進行組織固定；存活的豬則在攻毒后第32 天（d72）進行處死，并留取所需組織。

1.6 檢測指標(biāo)及數(shù)據(jù)處理

1.6.1 臨床癥狀觀察 每天觀察并記錄其食欲、被毛、皮膚、排便、行動及其他異常等情況，直至動物實驗結(jié)束。

1.6.2 體征檢測 分別于免疫當(dāng)日（d1）、攻毒當(dāng)日（d41）和宰殺當(dāng)日（d72）稱量所有豬的體重，計算各組在不同試驗階段的增重情況。于攻毒當(dāng)日開始記錄體溫，每天上午10 點鐘測定，直至體溫未見明顯升高，恢復(fù)平穩(wěn)為止。

1.6.3 Real-time RCR 檢測 分別于攻毒前3 d（d38）、攻毒后每周（d48、d55、d62、d69、）抽血一次，用Real-time RCR 方法檢測攻毒后不同階段血液內(nèi)的病毒含量。于動物宰殺時（d72）取新鮮肺及淋巴結(jié)組織，檢測組織中病毒含量。

1.6.4 組織病理學(xué)檢查 對福爾馬林固定的肺及淋巴結(jié)進行常規(guī)石蠟切片及H.E.染色，并進行讀片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性抗體檢測結(jié)果 免疫前（d0）抽血檢測所有樣本豬圓環(huán)病毒2 型抗體均為陰性，首次免疫后1 周（d8），耦聯(lián)多肽疫苗免疫組和市售疫苗免疫對照組大部分樣本檢測到抗體，二免后，抗體水平呈上升趨勢，經(jīng)過加強免疫后，第4 周（d29）抗體滴度水平達到最高，第5 周（d36）檢測抗體水平趨于平穩(wěn)（見圖1）。

圖1 不同免疫階段特異性抗體檢測結(jié)果

2.2 臨床癥狀 4個試驗動物組在免疫前及攻毒前，動物的食欲、被毛、皮膚、行動及精神狀態(tài)等觀察均正常。攻毒后，耦聯(lián)多肽疫苗和市售疫苗兩個免疫組臨床觀察未見明顯異常；免疫佐劑對照組和空白對照組分別在攻毒后第9天和第7天出現(xiàn)精神委靡、被毛雜亂等，過2～3 d 開始嘔吐、水便、投食前臥地不起，空白對照組在攻毒后第11 天、第12 天早上各有1 例動物便血，中午發(fā)現(xiàn)死亡。

2.3 攻毒前后體征變化 免疫后至攻毒前，各個組的整體增重較平均，組間未見明顯差異。攻毒后至宰殺前，耦聯(lián)多肽疫苗組及市售疫苗組兩組的增重略有下降，但與攻毒前差別不大；而對照兩組的增重則明顯下降（見圖2）。

圖2 不同試驗階段各組平均增重

攻毒第2 天，各組體溫均有升高，但免疫佐劑對照組及空白對照組體溫升高明顯。至攻毒后第10 天，多肽疫苗及市售疫苗組體溫趨于平穩(wěn)，恢復(fù)至攻毒前水平；對照兩組的體溫較攻毒前仍略偏高（見圖3）。

圖3 攻毒后各組動物的平均體溫變化趨勢

2.4 Real-time PCR 檢測結(jié)果 4 個組在攻毒前及攻毒后1 周、2 周的血液內(nèi)均未檢測出病毒，攻毒后3 周和4 周在空白對照組和免疫佐劑對照組分別檢測出較高含量的病毒，而疫苗免疫兩組未檢測出。攻毒試驗結(jié)束后，佐劑及空白對照組均在肺及淋巴結(jié)組織中檢測到較高含量的病毒，而疫苗免疫兩組亦未在組織中檢測到病毒。

2.5 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 耦聯(lián)多肽疫苗及市售疫苗免疫兩組的易感組織：肺臟和淋巴結(jié)大體觀察未見明顯異常；組織學(xué)觀察未見明顯病變（見中插彩版圖4A-D）。免疫佐劑及空白對照兩組：大體觀察見肺臟腫脹、呈灰褐色彌漫性病灶、質(zhì)硬，淋巴結(jié)腫大、切面質(zhì)硬；組織學(xué)觀察見肺組織細胞及巨噬細胞增生、彌散性肺泡壁增厚、局灶性肉芽腫性間質(zhì)肺炎（見中插彩版圖7E、G）；淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)排列疏松、淋巴細胞減少，副皮質(zhì)區(qū)可見上皮樣細胞，胞漿內(nèi)見嗜酸性包涵體（見中插彩版圖7F、H）。具體病理組織圖片見圖4。

3 討論

本研究所用的多肽疫苗是根據(jù)PCV-2 病原體抗原基因中已知和預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸多肽序列，耦聯(lián)到大分子多糖載體上所得到的多肽。大分子量載體作用是增強其免疫效果，傳統(tǒng)方法是應(yīng)用戊二醛等連接分子法將有效抗原肽接到載體蛋白鑰孔血藍蛋白（KLH）、人血清白蛋白（HSA）、卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）及破傷風(fēng)類毒素（TT）上，但是此類抗原肽-載體復(fù)合疫苗中的載體蛋白通常為異體蛋白，因此在免疫接種時容易引起炎癥或過敏反應(yīng)，還會影響抗原肽的特異性，因此選擇一種無過敏反應(yīng)的載體尤為關(guān)鍵。本研究所采用的載體是優(yōu)選的具有可耦聯(lián)基團的非蛋白多聚體，與免疫活性多肽耦聯(lián)，制備成耦聯(lián)多肽疫苗，試驗驗證其不但具有顯著的免疫活性及穩(wěn)定性，還避免了傳統(tǒng)多肽-載體蛋白疫苗所引起的炎癥或過敏反應(yīng)等毒副作用，極大的提高了多肽疫苗的安全性和特異性，且其具有制備工藝簡單、成本低、質(zhì)量可靠等優(yōu)點，利于規(guī)?；a(chǎn)。

體液免疫效果是疫苗免疫評價重要標(biāo)準(zhǔn)之一，本試驗針對PCV-2 特異性抗體進行動態(tài)檢測，其結(jié)果表明，本研究制備的耦聯(lián)多肽疫苗具有與市售疫苗相似的免疫效果，可以有效提高機體體液免疫能力。臨床癥狀觀察及體征檢測同樣可以對疫苗免疫效果做出客觀評價，臨床觀察經(jīng)多肽疫苗免疫的豬在攻毒后未見發(fā)病及死亡，增重及體溫檢測也說明攻毒后的多肽疫苗組動物體征與對照組變化差異明顯，與攻毒前體征水平相當(dāng)，表明耦聯(lián)多肽疫苗臨床免疫具有良好的保護效果。

豬感染PCV-2 后，不但可以通過胎盤進行垂直傳播，還可經(jīng)鼻液和糞便進行水平傳播，該病毒對環(huán)境理化因子抵抗力極強，在酸性及高溫環(huán)境下同樣可以存活一定時間。因此，有效減少排毒量，減短帶毒血癥時間，是評價PCV-2 疫苗的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。本試驗通過檢測攻毒后不同階段的各組動物血液內(nèi)病毒含量，表明經(jīng)多肽疫苗免疫的豬能夠有效抑制病毒血癥的發(fā)生。同時，病毒可存在于機體多個器官，并導(dǎo)致相應(yīng)器官的功能異常，其中淋巴結(jié)和肺臟是PCV-2 病毒復(fù)制的重要的器官，感染后不但可以造成呼吸功能障礙，更重要的是可以引起機體免疫抑制，為其他病原的感染提供途徑，因此，高效PCV-2 疫苗應(yīng)該具有有效減少淋巴結(jié)、肺臟等病毒靶器官內(nèi)病毒滴度的能力。本試驗在耦聯(lián)多肽疫苗免疫組的淋巴結(jié)及肺臟組織樣本中未檢測出病毒，表明該多肽疫苗具有良好的阻斷病毒感染靶器官的能力。病理學(xué)觀察結(jié)果同樣表明，實驗動物免疫該耦聯(lián)多肽疫苗后，與對照組相比較，淋巴結(jié)和肺臟未出現(xiàn)病理變化，再次說明，本研究所用耦聯(lián)多肽疫苗可以有效抑制PCV-2 病毒在靶器官內(nèi)的復(fù)制，并減少病毒所致的病理變化，避免機體出現(xiàn)免疫抑制、呼吸功能障礙等臨床癥狀。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PCV-2 耦聯(lián)多肽疫苗具有較好的免疫效果及保護率。作為一種候選新型疫苗，其獨特的優(yōu)點能為企業(yè)和市場帶來新的經(jīng)濟增長點與競爭力，市場空間巨大。同時該疫苗的研制方法也可為其他相關(guān)疾病疫苗的研制提供重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，對我國動物疫苗的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。

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