閆昆明 劉 英 張 芮 郭世杰 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院新生兒科，長春 130021)

新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)迄今仍是造成新生兒死亡和導(dǎo)致永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因［1］。HIE 發(fā)病機制極其復(fù)雜，有關(guān)腦損傷的機理尚不完全清楚。本研究通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)動物模型，在不同時間點取腦組織，觀察神經(jīng)細胞凋亡、半胱天冬酶-3(caspase-3)蛋白表達、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化，旨在對HIBD 后細胞凋亡基因及自由基損傷的機制作進一步的探討，為臨床治療HIBD 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 兔抗大鼠caspase-3 抗體(1∶100)、HRP-多聚體抗兔、DAB 顯色試劑盒及TUNEL 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;SOD、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所;自制常壓缺氧艙，30 cm ×40 cm ×50 cm 有機玻璃艙，兩側(cè)各有一直徑1 cm 小孔，一側(cè)通氮氧混合氣，另一側(cè)與測氧儀相通，底層鋪有鈉石灰以吸收CO2及濕氣;CY212C 型便攜式數(shù)字測氧儀(杭州電化分析儀器廠);Olympus AX 70 顯微鏡及全自動相機系統(tǒng);HPIAS-100 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)。

1.2 實驗動物及分組 選取新生7 d 齡健康Wistar大鼠共240 只，體質(zhì)量12～17 g，雌雄不限(由吉林大學(xué)實驗動物中心提供)。隨機分為假手術(shù)組120只:大鼠乙醚麻醉后作頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈后，不予結(jié)扎，直接縫合皮膚，放回母鼠籠中喂養(yǎng)。HIBD 組120 只:采用經(jīng)典的Ricec 法［2］建立新生大鼠HIBD 模型，乙醚麻醉下，頸正中切口，游離左側(cè)頸總動脈，用4-0 絲線結(jié)扎，縫合切口后回窩1 h，后將大鼠置濕度為70%±5%，37℃恒溫的自制常壓缺氧艙中，以2 L/min 速度輸入含8% 氧氣、92%氮氣的混合氣體，持續(xù)2 h，放回母鼠籠中喂養(yǎng)。每組根據(jù)不同時間點又分為6 個亞組:6 h 組、12 h組、24 h 組、48 h 組、72 h 組、96 h 組。每亞組20 只。

1.3 腦組織病理檢測(HE 染色) 每一時間點，每組大鼠各5 只，斷頭取左腦，保存于4%多聚甲醛溶液中，固定72 h 以上。腦組織經(jīng)脫水，石蠟包埋，以視交叉和乳頭體中部為切面行冠狀切片，片厚5 μm，HE 染色，光鏡觀察病理改變。

1.4 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測 切片做HE 染色，光鏡觀察后，鄰近處的石蠟切片定為標記組織，并取假手術(shù)組相對應(yīng)組織，作為陰性對照。按TUNEL 檢測試劑盒操作。TUNEL 標記陽性凋亡細胞為胞核呈棕黃色，胞漿不著色。采用HPIAS-100 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，在TUNEL 染色切片相鄰兩個層面，分別于皮質(zhì)、紋狀體、海馬各取10 個視野，計數(shù)平均1.0 mm2內(nèi)凋亡細胞數(shù)［3］。

1.5 caspase-3 蛋白的檢測 石蠟切片進行免疫組化染色，具體步驟按照免疫組化試劑盒說明書操作。caspase-3 陽性細胞為胞漿出現(xiàn)黃色顆粒。所有切片均在同一光強度下，400 倍光鏡下進行分析。每只大鼠取兩張腦組織切片，取皮質(zhì)、紋狀體和海馬各5 個視野，經(jīng)數(shù)碼相機采樣，輸入HPIAS-100 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，計算免疫陽性細胞的平均光密度(OD)。

1.6 MDA 和SOD 檢測 每一時間點，每組大鼠各15 只，斷頭取左側(cè)腦組織稱重，按重量體積比1∶9生理鹽水制成10%腦組織勻漿，4℃4 000 r/min 離心10 min，取上清液，-40℃保存待測MDA 和SOD。硫代巴比妥酸法測定MDA 含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD 含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s 表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD 法，相關(guān)性分析采用Pearson 法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠腦組織光鏡檢查 假手術(shù)組各時間點腦組織結(jié)構(gòu)層次清晰。神經(jīng)細胞排列整齊，形態(tài)正常，核仁清楚(圖1A)。與假手術(shù)組比較，HIBD組左側(cè)腦組織明顯膨出、腫脹、腦回增寬、腦溝變淺。光學(xué)顯微鏡下，HIBD 組6～24 h 可見少量神經(jīng)元胞體腫脹、膠質(zhì)細胞增生、細胞間隙增寬，48～72 h 上述病變加重，細胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清、神經(jīng)元變性，部分神經(jīng)細胞核固縮變圓呈強嗜堿性、胞漿紅染加深、核濃縮、膠質(zhì)細胞增生活躍(圖1B)。72、96 h可見到明顯的梗死灶。

2.2 兩組大鼠神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量的比較 假手術(shù)組偶見陽性細胞，各時間點陽性細胞數(shù)無顯著差異(圖2A)。HIBD 組6 h 陽性凋亡細胞開始增多，24 h 較為明顯，48 h 達高峰，陽性信號最著，顏色深棕色，范圍廣及皮質(zhì)、紋狀體、海馬(圖2B)，其后陽性細胞漸減少，6～96 h 各時間點陽性細胞數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.05)。見表1。

2.3 兩組大鼠腦組織caspase-3 蛋白表達的比較

假手術(shù)組各時間點偶見caspase-3 陽性細胞(圖3A)。HIBD 組caspase-3 的表達6 h 后開始增強，12 h 時逐漸上升，48 h 達高峰(圖3B)，隨著時間推移逐漸降低，6～96 h caspase-3 的表達較假手術(shù)組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

2.4 兩組大鼠腦組織MDA 含量的比較 HIBD 組MDA 含量6 h 增高，24 h 達高峰，6～96 h MDA 含量較假手術(shù)組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

2.5 兩組大鼠腦組織SOD 含量的比較 HIBD 組SOD 含量6 h 下降，24 h 降至最低，6～96 h SOD 含量較假手術(shù)組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)(見表4)。

2.6 相關(guān)性分析 HIBD 組大鼠以神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量為應(yīng)變量，caspase-3 蛋白表達量、MDA 和SOD含量為自變量進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，凋亡細胞數(shù)量與caspase-3 蛋白表達量和MDA 含量均呈正相關(guān)(r=0.748、0.654，P 均＜0.05)，與SOD 含量呈負相關(guān)(r=-0.576，P ＜0.05)。以caspase-3 蛋白表達量為應(yīng)變量，MDA 和SOD 含量為自變量進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，caspase-3蛋白表達量與MAD含量呈正相關(guān)(r=0.603，P ＜0.05)，與SOD 含量呈負相關(guān)(r=-0.538，P ＜0.05)。以MDA 含量為應(yīng)變量，SOD含量為自變量進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MAD 含量與SOD含量呈負相關(guān)(r=-0.675，P ＜0.05)。

圖1 假手術(shù)組和HIBD 組72 h 皮質(zhì)(HE，×200)Fig.1 Cortex of sham operation group and HIBD group in 72 hours (HE，×200)

圖2 假手術(shù)組和HIBD 組48 h 海馬(TUNEL，×400)Fig.2 Hippocampus of sham operation group and HIBD group in 48 hours (TUNEL，×400)

圖3 假手術(shù)組和HIBD 組48 h 皮質(zhì)caspase-3 表達(免疫組織化學(xué)，×400)Fig.3 Expression of caspase-3 in cortex of sham operation group and HIBD group in 48 hours (immunohistochemistry，×400)

表1 兩組大鼠不同時間點TUNEL 陽性細胞數(shù)比較(±s，/mm2，n=5)Tab.1 Positive cell counts of TUNEL at different time in two groups(±s，/mm2，n=5)

表1 兩組大鼠不同時間點TUNEL 陽性細胞數(shù)比較(±s，/mm2，n=5)Tab.1 Positive cell counts of TUNEL at different time in two groups(±s，/mm2，n=5)

Note:Compared with sham operation group，1)P ＜0.05.

表2 兩組大鼠不同時間點caspase-3 蛋白表達量的比較(±s，OD，n=5)Tab.2 Level of caspase-3 expression at different time in two groups(±s，OD，n=5)

表2 兩組大鼠不同時間點caspase-3 蛋白表達量的比較(±s，OD，n=5)Tab.2 Level of caspase-3 expression at different time in two groups(±s，OD，n=5)

Note:Compared with sham operation group，1)P ＜0.05.

表3 兩組大鼠不同時間點腦組織MDA 含量的比較(±s，nmol/mg 蛋白，n=15)Tab.3 Level of MDA in brain at different time in two groups(±s，nmol/mg pro，n=15)

表3 兩組大鼠不同時間點腦組織MDA 含量的比較(±s，nmol/mg 蛋白，n=15)Tab.3 Level of MDA in brain at different time in two groups(±s，nmol/mg pro，n=15)

Note:Compared with sham operation group，1)P ＜0.05.

表4 兩組大鼠不同時間點腦組織SOD 含量的比較(±s，U/mg 蛋白，n=15)Tab.4 Level of SOD in brain at different time in two groups(±s，U/mg pro，n=15)

表4 兩組大鼠不同時間點腦組織SOD 含量的比較(±s，U/mg 蛋白，n=15)Tab.4 Level of SOD in brain at different time in two groups(±s，U/mg pro，n=15)

Note:Compared with sham operation group，1)P ＜0.05.

3 討論

HIBD 是一個多因素、多機制的級聯(lián)損傷過程，這個級聯(lián)過程包括許多環(huán)節(jié)，如能量代謝障礙、興奮性氨基酸釋放、炎性反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣超載、再灌注及自由基損傷、凋亡基因激活等［4，5］。這些環(huán)節(jié)互為因果并相互聯(lián)系，最終導(dǎo)致細胞損傷凋亡。

研究表明，自由基在HIBD 的病理生理機制中發(fā)揮重要作用。正常情況下，機體存在著清除和抑制自由基產(chǎn)生的系統(tǒng)，SOD 是體內(nèi)主要自由基清除劑，保護生物體免受自由基的攻擊。當(dāng)機體遭受到HI 損傷，產(chǎn)生和清除自由基系統(tǒng)失去正常平衡，造成自由基增多。引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成一系列脂質(zhì)自由基及其降解產(chǎn)物MDA，從而引起細胞損傷，導(dǎo)致細胞及細胞屏障損害，神經(jīng)元壞死或凋亡，引起和加重缺血腦組織水腫。神經(jīng)組織可能由于以下幾個原因?qū)ψ杂苫鸬膿p傷特別敏感:(1)神經(jīng)組織含有大量的磷脂易被氧自由基破壞。(2)腦內(nèi)過氧化氫酶活性較低，且SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶活性也不高。(3)神經(jīng)組織內(nèi)含有大量溶酶體，當(dāng)溶酶體膜破壞后，其內(nèi)的水解酶釋放使神經(jīng)元本身進一步損傷。(4)腦組織內(nèi)含鐵較多，鐵離子是缺血缺氧時自由基形成的一種重要的催化劑［6］。

MDA 水平反映體內(nèi)氧自由基的生成水平，其產(chǎn)生量與氧自由基的量及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)相平行，間接地反映氧自由基水平的變化和細胞膜損傷的程度。SOD 通過歧化方式將O2-轉(zhuǎn)化為毒性較低的H2O2，H2O2又被過氧化氫酶或谷胱甘肽氧化酶清除，因此，SOD 在組織中的活性常作為清除氧自由基能力的主要指標［7］。

本研究結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠腦組織MDA水平較低，HIBD 組大鼠腦組織于HI 后6 h 增高，24 h 達高峰，后逐漸下降。而SOD 水平在假手術(shù)組大鼠腦組織中含量較高，HIBD 組大鼠腦組織于HI 后各時間點均較假手術(shù)組降低，其中HI 后24 h 降到最低點，說明腦組織缺氧缺血后氧自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，抗氧化酶大量消耗。提示缺氧缺血后腦組織清除氧自由基的能力明顯減弱，腦組織中堆積的氧自由基對腦細胞必然產(chǎn)生進一步的損傷。

自由基也是一種重要的信號分子，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)［8］。當(dāng)HI 后，由于氧化應(yīng)激的刺激，引起線粒體內(nèi)膜的跨膜壓減低，線粒體內(nèi)膜的通透轉(zhuǎn)換孔開放，導(dǎo)致線粒體外膜破裂，線粒體膜通透性的改變導(dǎo)致細胞色素C 和線粒體源caspase 的第二個激活因子釋放入胞漿，通過caspase 途徑啟動凋亡的發(fā)生。caspase-9 參與線粒體通路的細胞凋亡，為誘導(dǎo)凋亡的啟動基因，caspase-9 活化后，即開啟細胞內(nèi)的死亡程序，通過異源活化方式水解激活下游的caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡［9］。

本研究結(jié)果表明，HIBD 組大鼠腦組織各時間點caspase-3 的表達量與神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量均明顯增加，48 h 達高峰，然后逐漸減少，兩者變化趨勢一致，呈正相關(guān)。同時兩者與MDA 含量呈正相關(guān)，與SOD 含量呈負相關(guān)。提示氧自由基損傷促進caspase-3 的激活及神經(jīng)細胞的凋亡。

HIBD 是一個動態(tài)的發(fā)展過程，24～72 h 為腦損傷高峰期，這種動態(tài)變化為HIBD 的防治提供了一個時間窗，因此在此期間通過應(yīng)用抑制自由基生成的藥物以阻止細胞凋亡，為臨床進行抗凋亡治療提供理論依據(jù)。

［1］Perlman JM.Summary proceedings from the neurology group on hypoxic-ischemic encephalopathy［J］.Pediatrics，2006，117(3 Pt 2):S28-S33.

［2］Rice JE，Vannucci RC，Brierley JB.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat［J］.Ann Neura1，1981，9(2):131-141.

［3］Wijesman JH，Jonker RR，Keijzer R，et al.A new method to detect apoptosis in paraffin sections:in situ end-labeling of fragmented DNA［J］.J Histochem Cytochem，1993，41(1):7-12.

［4］龍 梅，王 瓊，閆玉仙，等.三七總皂苷對缺血再灌注損傷后大鼠腦組織的MDA、GSH-PX 表達的影響［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2013，13(12):2257-2260，2272.

［5］Northington FJ，Chavez-Valdez R，Martin LJ.Neuronal cell death in neonatal hypoxia-ischemia［J］.Ann Neurol，2011，69 (5):743-758.

［6］姜春明，于 暢，米 延.亞低溫對新生鼠缺氧缺血性腦損傷自由基影響的研究［J］.小兒急救醫(yī)學(xué)，200l，8(4):217-218.

［7］蔡宏斌，葛朝明，張?zhí)m芳，等.不同壓力高壓氧預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血-再灌注自由基損傷的保護作用［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26(9):803-806.

［8］Chandel NS，McClintock DS，F(xiàn)eliciano CE，et al.Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex Ⅲstabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia:a mechanism of O2sensing［J］.J Biol Chem，2000，275(33):25130-25138.

［9］Raha S，Robinson BH.Mitochondria，oxygen free radicals，and apoptosis［J］.Am J Med Genet，2001，106(1):62-70.