江澤波 趙 晉 李思明 胡金萍 曾 星

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州 510006)

多糖可活化機(jī)體免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)白介素及腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子分泌，在機(jī)體抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)等方面?zhèn)涫荜P(guān)注［1，2］，是目前常用的免疫調(diào)節(jié)劑。近期相關(guān)研究表明，豬苓多糖可以通過TLR4 信號(hào)通路活化巨噬細(xì)胞，刺激TNF-α、IL-1β 等炎癥因子分泌，并提高膀胱癌大鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD86、CD40的陽性表達(dá)率［3-5］，但其對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞作用機(jī)制尚未明確。而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞類似于M2 亞型巨噬細(xì)胞，兩者均具有抗炎、降低腫瘤殺傷來保護(hù)機(jī)體［6-8］。本文借助腫瘤相關(guān)的M2 亞型巨噬細(xì)胞模型，觀察豬苓多糖對(duì)M2 亞型巨噬細(xì)胞膜表面分子和相關(guān)炎癥因子的作用，探討豬苓多糖啟動(dòng)巨噬細(xì)胞可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 為廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。含丙酮酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基、雙抗(Gibco)、胎牛血清(FBS)購于Hyclone 公司，TRIZOL 試劑購于Invitrogen 公司、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)、熒光定量PCR 試劑盒(羅氏);流式抗體:CD16/32-FITC(ABCCM)，CD40-PECY5，大鼠IGg-FITC(eBiscience)，Rat IgG2a K Isotype Control PE-Cy5(eBioscience)，Rat IgG2a K Isotype Control RPE(ABCAN，USA)Rat IgG2a K Isotype Control FITC(eBioscience)，異丙醇、無水乙醇、氯仿(廣州化學(xué)試劑廠)，IL-4(Peprotech，USA);流式抗體CD23-PECY5，CD206-RPE(ABCAN，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 用含100 ml/L 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 氯霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基37℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為:空白對(duì)照組，IL-4 誘導(dǎo)的M2 亞型巨噬細(xì)胞，IL-4 +豬苓多糖低、中、高劑量組，豬苓多糖劑量分別為終濃度分別為50、100、200 μg/ml 的PPS 處理。

1.2.2 IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞株RAW264.7 為M2 亞型巨噬細(xì)胞及其檢測(cè) M2 亞型巨噬細(xì)胞模型的構(gòu)建，根據(jù)文獻(xiàn)［9］研究，給予終濃度為20 ng/ml 的細(xì)胞因子IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞株RAW264.7 極化為替代活化形式的M2 模式的巨噬細(xì)胞亞型。誘導(dǎo)24 h，然后收集細(xì)胞上清，PBS 洗滌巨噬細(xì)胞，消化調(diào)整數(shù)于流式管當(dāng)中，加入2 ml 的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，離心去掉上清，加入PBS 200 μl 重懸細(xì)胞，然后加入相應(yīng)的抗體CD23-PECY5、CD206-RPE 和CD16/32-FITC 各1 μl，對(duì)應(yīng)的同型作為陰性對(duì)照。4℃避光孵育30 min，然后PBS 離心去除游離的流式抗體，500 μl PBS 重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)相關(guān)膜表面分子的陽性表達(dá)率，膜表面分子蛋白特異性驗(yàn)證M2 亞型巨噬細(xì)胞的極化成功。同時(shí)TRIZOL收集巨噬細(xì)胞，以qRT-PCR 檢測(cè)ARG1、IL-10、TGFβ、iNOSmRNA 的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證M2 亞型的構(gòu)建成功。

1.2.3 豬苓多糖對(duì)M2 亞型巨噬細(xì)胞膜分子的影響 誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 為M2亞型巨噬細(xì)胞后，給予相應(yīng)的不同濃度的豬苓多糖溶液干預(yù)24 小時(shí)，收集細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞濃度，加入相應(yīng)的流式抗體CD16/32、CD206、CD40 各1 μl，避光孵育30 min，然后加入PBS 洗去游離的流式抗體，加入500 μl 的PBS 溶液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的膜分子的表達(dá)量。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)豬苓多糖對(duì)M2 亞型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA 的影響 IL-4 刺激24 h 的巨噬細(xì)胞去上清，加入相應(yīng)的藥物進(jìn)行干預(yù)24 h，然后每孔加入1 ml 的TRIZOL 反復(fù)吹打，收集細(xì)胞于無酶的1.5 ml 的EP 管當(dāng)中，-80℃保存或者繼續(xù)提取總RNA。按照試劑說明提取總RNA，然后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度，按1 μg 的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增iNOS，IL-1β，IL-10，TNF-α mRNA 的基因編碼片段。基因引物序列分別為 mus-GAPDH Forward-5'-GTTTTCAG-GGATGAAGCGGC-3'，Reverse-5'-TGGGATAGGGCC-TCTCTTGC-3';IL-10Forward-5'-TACTCGGCAAACC-TAGTGCG-3'，Reverse-5'-GTGTCCCAACATTCATAT-TGTCAGT-3';IL-1β Forward-5'-TGGGATAGGGCC-TCTCTTGC-3'，Reverse-5'-CCATGGAATCCGTGTC-TTCCT-3';TNF-ɑ Forward-5'-GTGTCCCAACATTCA-TATTGTCAGT-3'，Reverse-5'-TGGGAAGAGAAACC-AGGGAGA-3';iNOS Forward-5'-TGAGTTCCGAAGCAAGCCAA-3'，Reverse-5'-AGACCTCAACAGAGCC-CTCA-3'，ARG1 Forward-5'-TACAAGACAGGGCTCCTTTCAG-3'，Reverse-5'-TGAGTTCCGAAGCAAGC-CAA-3'。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒的說明:2 × SYBR Green 10 μl、上下游引物終濃度0.4 μmol/L、cDNA模板10 μl、DEPC 水12 μl，反應(yīng)總體系為20 μl。按照擴(kuò)增試劑盒的程序:欲變性95℃10 min，變性95℃15 s，60℃34 s 退火，45 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)基因的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P ＜0.05值為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2 鑒定指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、圖1 所示，給予IL-4 誘導(dǎo)24 h 后，和未刺激的RAW64.7 比較，CD16/32 表達(dá)水平略高，但和空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);而CD206分子表達(dá)顯著增高(P ＜0.05)，提示IL-4 誘導(dǎo)M2 亞型巨噬細(xì)胞成功。

表1 IL-4 誘導(dǎo)RAW64.7 極化為M2 亞型膜分子表達(dá)的情況(n=3，%)Tab.1 Expression of membrane surface molecules on IL-4-induced M2 macrophages(n=3，%)

圖1 IL-4 誘導(dǎo)的M2 亞型巨噬細(xì)胞膜表面分子CD206 和CD16/32 的陽性表達(dá)率Fig.1 Expression of CD206 and CD16/32 on IL-4-induced M2 macrophages

圖2 IL-4 誘導(dǎo)的M2 亞型巨噬細(xì)胞mRNA 表達(dá)量Fig.2 Expression of mRNA on IL-4-induced M2 macrophages

表2 豬苓多糖對(duì)M2 亞型巨噬細(xì)胞膜分子表達(dá)的影響(n=3，%)Tab.2 Expression of membrane surface molecules of PPS on IL-4-induced M2 macrophages(n=3，%)

表3 豬苓多糖對(duì)IL-4 誘導(dǎo)的模型細(xì)胞因子mRNA 的影響(n=3)Tab.3 Expression of mRNA of PPS on IL-4-induced M2 macrophages(n=3)

2.2 qRT-PCR 鑒定IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2亞型巨噬細(xì)胞 如圖2 所示，給予IL-4 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞24 h 后，和空白對(duì)照組比較，ARG1 mRNA 的表達(dá)量明顯升高［(2.88±0.08)倍，P ＜0.01)］，IL-10 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高了(1.89±0.15)倍，(P ＜0.01)，TGF-β mRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高了(3.95±0.37)倍，iNOS 減低到(0.605±0.09)，和空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.3 豬苓多糖對(duì)M2 亞型巨噬細(xì)胞膜分子的影響給予豬苓多糖干預(yù)后，CD206 的表達(dá)量降低，CD16/32、CD40 的表達(dá)量升高，劑量依賴性明顯，和模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，詳見表2。

2.4 豬苓多糖對(duì)M2 亞型巨噬細(xì)胞模型細(xì)胞因子mRNA 的影響 從表3 可知:巨噬細(xì)胞模型予豬苓多糖干預(yù)后，相應(yīng)的炎癥因子TNF-α、IL-1βmRNA的表達(dá)量升高，特異性M1 指標(biāo)iNOS mRNA 呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，兩者與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);IL-10 的表達(dá)量隨著豬苓多糖劑量的升高而呈正相關(guān)趨勢(shì)。綜上可推測(cè)豬苓多糖通過提高炎癥因子的相對(duì)表達(dá)量來調(diào)節(jié)M2 亞型巨噬細(xì)胞生物活性。

3 討論

巨噬細(xì)胞是一種具有可塑性和多能性的細(xì)胞群體［10］，體內(nèi)外局部微環(huán)境的不同直接影響巨噬細(xì)胞的分化和功能差異［11，12］，目前主要極化兩種亞型:經(jīng)典M1 亞型(Classical activated macrophage)和替代M2 亞型(Alternative activated macrophage)，其中M1 亞型主要以抗腫瘤和增強(qiáng)免疫為主，M2 亞型則具有抗炎和介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸作用。腫瘤微環(huán)境傾向于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 優(yōu)勢(shì)活化，作為腫瘤組織中數(shù)量最多的抗原提呈細(xì)胞，M2 亞型巨噬細(xì)胞僅有較弱的抗原提呈能力，高表達(dá)CD23、CD206 等膜表面分子，并通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGFβ 等下調(diào)免疫應(yīng)答，降低炎癥因子過表達(dá)對(duì)機(jī)體的損害［13，14］。在體外培養(yǎng)條件下，通過Th2 型細(xì)胞因子(如IL-4、IL-13 等)可誘導(dǎo)產(chǎn)生M2 亞型巨噬細(xì)胞［9］，并與體內(nèi)極化的巨噬細(xì)胞具有高度相似的表型和功能，這也是目前研究巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的重要手段。

本研究采用經(jīng)典的Th2 型細(xì)胞因子IL-4 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞株24 h，極化后的巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2 特異性的標(biāo)志物ARG1，表明IL-4 誘導(dǎo)M2亞型巨噬細(xì)胞有效可行。造模成功后給予不同劑量的豬苓多糖干預(yù)，IL-10 等抑制性炎癥因子表達(dá)升高，并與濃度呈正相關(guān)，且M1 型巨噬細(xì)胞特異性的指標(biāo)iNOSmRNA 同時(shí)明顯升高，結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道，可知豬苓多糖，尤其是高劑量豬苓多糖可促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M2 亞型轉(zhuǎn)換M1 亞型，起保護(hù)機(jī)體作用。隨后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了豬苓多糖干預(yù)細(xì)胞模型后的M1/M2 特異性的膜分子蛋白指標(biāo)，可見M2 特異性指標(biāo)CD206 表達(dá)率降低，而CD16/32、CD40 等M1 特異性指標(biāo)反而升高，提示豬苓多糖可活化巨噬細(xì)胞由M2 亞型逆轉(zhuǎn)為M1 亞型，體現(xiàn)了人體免疫動(dòng)態(tài)平衡的可控性，同時(shí)與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)變化的連續(xù)過程相切合。結(jié)合qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)豬苓多糖可以增加IL-1β，TNF-α 等相應(yīng)炎癥因子水平，并提高M(jìn)1 膜表面分子CD16/32、CD40 表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證了豬苓多糖通過TLR4 途徑活化巨噬細(xì)胞的同時(shí)，可能通過過活化CD14 信號(hào)通路起作用。

綜上所述，豬苓多糖可有效活化巨噬細(xì)胞，起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤作用。此外，豬苓多糖在抗熱休克蛋白過程中可增加抑制性細(xì)胞因子IL-10 的分泌而起減輕炎癥的作用，除外TLR4 途徑及CD14 信號(hào)通路，豬苓多糖是否可通過影響IL-10 相關(guān)通路來活化巨噬細(xì)胞，尚待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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