劉 博，董 超，米 陽(yáng)，侯正欣

(1.河北省靈壽縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 靈壽 050500； 2.河北省科學(xué)院 生物研究所,河北 石家莊 050081)

產(chǎn)纖溶酶的海洋放線菌小鼠急毒和抗生素敏感實(shí)驗(yàn)

劉 博1，董 超2，米 陽(yáng)2，侯正欣2

(1.河北省靈壽縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 靈壽 050500； 2.河北省科學(xué)院 生物研究所,河北 石家莊 050081)

介紹了檢測(cè)產(chǎn)纖溶酶的放線菌株MY0504的毒性和抗生素敏感性的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)液體搖瓶發(fā)酵得到MY0504的發(fā)酵液，分別小鼠灌胃發(fā)酵原液和除去菌提到發(fā)酵液；采用抗生素抑制菌圈法測(cè)試了5種抗生素對(duì)MY0504菌株的生長(zhǎng)影響。結(jié)果表明小鼠灌胃給藥的最大給藥量為80ml/kg，該受試物毒性較??；MY0504對(duì)常用抗生素比較敏感。

海洋放線菌；急毒實(shí)驗(yàn)；抗生素敏感

血栓導(dǎo)致的心腦血管病一般表現(xiàn)為心梗和中風(fēng),現(xiàn)在臨床的治療方案還是以溶栓為主，溶栓藥物包括鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、蚓激酶、葡激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)和瑞替普酶，還有目前研究較熱的納豆激酶等，它們?cè)诓煌矫娲嬖谝欢ㄈ毕?，如有免疫反?yīng)、對(duì)血液纖維蛋白專一性差、半衰期短或價(jià)格昂貴等[1]。

海洋蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，絕大多數(shù)的海洋微生物還沒(méi)被人類認(rèn)識(shí)和培養(yǎng)。由于海洋的高鹽、低溫、低營(yíng)養(yǎng)等特殊環(huán)境，海洋微生物的代謝途徑與陸地微生物差異較大，可以產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]。我們從從渤海灣海泥樣本中篩選得到了一株產(chǎn)產(chǎn)纖溶酶的放線菌株MY0504，分泌的纖溶酶分子量小，約15KD。液體深層發(fā)酵的纖溶酶活性可以達(dá)到500U/mL左右。為了檢測(cè)菌株發(fā)酵液的安全性，我們采用小鼠灌胃檢測(cè)了其急毒劑量，采用了5種常用的抗生素，檢測(cè)了其敏感性。促進(jìn)了該菌株在纖溶酶藥物方面的應(yīng)用開(kāi)發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛纖維蛋白原(Sigma公司)；凝血酶(石家莊市華瑞創(chuàng)新生物科技開(kāi)發(fā)中心)；注射用尿激酶(遼寧衛(wèi)星制藥廠有限責(zé)任公司) ；臺(tái)式保溫培養(yǎng)箱(PW/10-002重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；青霉素、桿菌肽：華北制藥集團(tuán)股份有限公司；四環(huán)素：北京賽孚制藥股份有限公司；環(huán)丙沙星、慶大霉素：新鄉(xiāng)市常樂(lè)制藥責(zé)任有限公司。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)條件

受試物：放線菌液原液A和放線菌液過(guò)濾液B，河北省科學(xué)院生物研究所提供。

試驗(yàn)地點(diǎn)：河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK(冀)2011-0047。

動(dòng)物種系：昆明種小鼠(清潔級(jí))，動(dòng)物合格證號(hào)為1410006。

動(dòng)物級(jí)別：SPF級(jí)。

動(dòng)物性別和數(shù)量：雌雄各半，體重18-20g。

飼養(yǎng)條件：光照12h/d，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～70%。籠養(yǎng)，4只/籠。

檢疫過(guò)程：新領(lǐng)到的動(dòng)物檢疫期5d。在檢疫期間觀察動(dòng)物飲水、攝食和健康狀況，以及是否存在疾病和死亡征兆。

飲水：普通用水灌裝飲水瓶，供動(dòng)物自由飲用。每日沖洗飲水瓶并換水一次。

墊料：購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隔日更換。

動(dòng)物標(biāo)識(shí)：動(dòng)物識(shí)別采用5%苦味酸標(biāo)記。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)試驗(yàn)測(cè)定LD50

采用A和B液分別設(shè)定灌胃量1.0、5.0、10.0、30.0、60.0 ml/kg，觀察小鼠24h內(nèi)產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)，為臨床安全用藥提供參考信息[3]。

1.2.2 最大劑量灌胃試驗(yàn)[4]

取小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為兩組，每組20只，分別為對(duì)照組和給藥組．各組小鼠均禁食24h，然后給藥組小鼠用放線菌液A和B分別灌胃，容量為0.4ml/10g體重(最大容量)，一天共給藥二次，累積劑量為80ml/kg，對(duì)照組小鼠給予等容量?jī)艋?，觀察給藥后14d內(nèi)動(dòng)物一般狀態(tài)，毛色、體重、飲食、活動(dòng)、呼吸、運(yùn)動(dòng)、反射、眼檢指征、心血管指征、唾液分泌、排便等指標(biāo)變化。

1.2.3 常用抗生素對(duì)目標(biāo)菌株的抑制作用

將MY0504菌株的孢子用接種環(huán)挑取少部分在10ml無(wú)菌水中稀釋，高速搖勻，備用。將100mlPB培養(yǎng)基化開(kāi)降溫到45℃左右，加入2ml備用的孢子菌液，搖勻，鋪平板。配制如下抗生素的溶液(濃度見(jiàn)表5) ：青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、桿菌肽。取10μL點(diǎn)到上述平板上，24℃恒溫培養(yǎng)3天，測(cè)定抑菌圈的大小。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 預(yù)試驗(yàn)測(cè)定LD50

經(jīng)預(yù)試各小鼠均正常，未見(jiàn)死亡或其它不適狀態(tài)，所以無(wú)法測(cè)出LD50，故需要進(jìn)行最大給藥量試驗(yàn)。

2.2 最大劑量灌胃試驗(yàn)

A液灌胃結(jié)果見(jiàn)表1、表2，B液結(jié)果灌胃結(jié)果見(jiàn)表3、表4。結(jié)果顯示各組小鼠在14d內(nèi)一般狀態(tài)良好，毛色光滑，飲食及活動(dòng)未見(jiàn)異常，呼吸、運(yùn)動(dòng)、反射、眼檢指征、心血管指征、唾液分泌、排便等指標(biāo)均正常；給藥后第7d、第14d，給藥組雄性小鼠體重均較對(duì)照組降低(P<0.01)；給藥組雌性小鼠體重均無(wú)明顯差異(P>0.05)；但試驗(yàn)期間各組均無(wú)一死亡，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，其小鼠灌胃給藥的最大給藥量為80ml/kg。

表1 A液灌胃各組小鼠體重變化

與對(duì)照組比較 *P<0.05 **P<0.01

表2 A液灌胃各組小鼠進(jìn)食量變化 (g/只， n=10)

表3 B液灌胃各組小鼠體重變化

與對(duì)照組比較 *P<0.05 **P<0.01

表4 B液灌胃各組小鼠進(jìn)食量變化 (g/只， n=10)

2.3 MY0504菌株對(duì)常用抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

抗生素周邊某一直徑的抑菌圈表示對(duì)藥物敏感，小于或根本沒(méi)有說(shuō)明該菌株對(duì)抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的檢測(cè)方法[5]，參照各抗生素的敏感直徑得出MY0504的敏感程度如表5所示。由表5可知，該菌株對(duì)這幾種抗生素比較敏感，尤其對(duì)喹諾酮類的環(huán)丙沙星敏感。所以該菌株的實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)等是相對(duì)安全的，不會(huì)引起不可控制的感染等，這也利于該菌株的纖溶酶發(fā)酵應(yīng)用。

表5 菌株MY0504對(duì)常用抗生素的敏感程度

注：“+”為敏感，“++”為非常敏感

3 結(jié)論

(1)海洋放線菌MY0504產(chǎn)纖溶酶，并且小鼠急毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵液和菌體均可以達(dá)到小鼠灌胃最大量，無(wú)死亡和不適狀態(tài)，所以該菌株安全無(wú)毒。

(2)菌株MY0504對(duì)常用抗生素敏感，尤其是對(duì)喹諾酮類抗生素敏感，所以該菌株對(duì)環(huán)境安全，在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過(guò)程中不會(huì)引起不可控感染。

(3)海洋微生物由于環(huán)境特殊，一般的產(chǎn)物不同于陸地微生物。作為一株纖溶酶藥物應(yīng)用開(kāi)發(fā)菌株，MY0504分泌的纖溶酶分子量小，易吸收，相關(guān)發(fā)酵優(yōu)化和提取技術(shù)研究需要進(jìn)一步的工作。

[1] Kunamneni A,Ravuri B D,Saisha V,et al.Urokinase-a very popular cardiovascular agent[J].Recent Pat Cardiovase Drug Discov,2008,3(1):45-58.

[2] Knight V,Sanglier J J,Ditullio D,etal.Diversifying microbial natural products for drug discovery.Appl Microbiol Biotechnol,2003,1-28.

[3] 中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，編號(hào)[Z]GPT2-1，2005,3.

[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社(第二版)，2006.

[5] .P.哈雷.圖解微生物實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2012.

Mice acute toxicity and antibiotic sensitivity tests of a plasmin-producing marine actinomycete

LIU Bo1,DONG Chao2,MI Yang2,HOU Zheng-xin2

(1.ObstetricsandGynecologyofIntegrativeMedicineHospitalinLingshou;LingshouHebei050500,China; 2.InstituteofBiology,HebeiAcademyofSciencesShijiazhuangHebei050081,China)

To detect the toxicity and antibiotic sensitivity of a actinomycete MY0504 which can produce plasmin. Fermented liquid of MY0504 was obtained by liquid shake-flask fermentation, respectively fed mice fermented liquid and broth which is removed actinomycetes ; the effect of five kinds of antibiotics on the growth of MY0504 was tested by inhibition zone method. The maximum tolerant dosage of mice was 80ml/kg, it showed that the test substances was low toxicity; MY0504 is sensitive to commonly used antibiotics.

Marine actinomycete; Acute toxicity test; Antibiotic sensitivity

2015-06-30

河北省科技支撐項(xiàng)目(No:14273201D)

劉 博(1964-),女，河北靈壽人，主治中醫(yī)師，主要從事中醫(yī)婦科，特別是婦產(chǎn)血栓性疾病治療研究.

1001-9383(2015)03-0070-04

Q936

A