覃中毅，雷增杰，王 斌，陳東風(fēng)

第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所消化內(nèi)科，重慶400042

1961 年Jacob ＆ Monod 專著“Genetic regulatory mechanisms in the Synthesis of protein”的出版，標志著基因組中心法則的建立，這一經(jīng)典學(xué)說經(jīng)過50 年來的蓬勃發(fā)展，不斷地被補充、完善［1］，而各種具有基因調(diào)控功能RNA 也在不斷被人類發(fā)現(xiàn)并深入研究。近年來，測序手段的不斷革新讓我們在發(fā)現(xiàn)一小部分新的具有蛋白編碼功能的RNA 的同時，還發(fā)現(xiàn)了一類由基因組廣泛轉(zhuǎn)錄，長度大于200 nt 且不具備編碼蛋白潛能的核苷酸片段，稱為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)。不過，相對于序列結(jié)構(gòu)方面的認識，人類對LncRNA 功能的認識還比較欠缺。盡管如此，學(xué)者們通過現(xiàn)有的技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)LncRNA 在基因的表達調(diào)控、疾病的發(fā)生發(fā)展等多項生命活動中起著關(guān)鍵作用。

1 LncRNA 的分類

LncRNA 通常是根據(jù)其臨近的具有蛋白編碼功能的基因片段來進行編碼和分類的［2］，分為:(1)反義長鏈非編碼RNA(antisense-LncRNA):LncRNA 轉(zhuǎn)錄起始于臨近的具有編碼功能基因內(nèi)部或其3'端，且轉(zhuǎn)錄方向與之相反，并有至少一個外顯子的重疊;(2)正義長鏈非編碼RNA(sense-LncRNA):與反義剛好相反;(3)內(nèi)含子長鏈非編碼RNA:指LncRNA 轉(zhuǎn)錄起始于具有編碼功能基因的內(nèi)含子，且無任何外顯子的重疊;(4)雙向長鏈非編碼RNA(bidirectional LncRNA):起始于臨近的具有編碼功能基因的啟動子，具有雙向轉(zhuǎn)錄潛能的LncRNA;(5)基因間長鏈非編碼RNA(large intergenic non-coding RNA，LincRNA):指轉(zhuǎn)錄于兩個具有編碼功能基因間的LncRNA。

2 LncRNA 的作用機制及功能

近年來，LncRNA 被發(fā)現(xiàn)在各項生命活動中起著重要作用，包括調(diào)控胚胎干細胞干性、細胞周期及腫瘤細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移等［3-5］。其作用機制的研究近年來也有一定的進展，普遍認為LncRNA 通過與特定的蛋白質(zhì)形成RNA 蛋白復(fù)合物來發(fā)揮作用［6］。其主要包括:(1)誘餌作用(Decoy):LncRNA 可以誘導(dǎo)一系列具有基因調(diào)控功能的蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子等并與之結(jié)合，使其無法結(jié)合到相應(yīng)的功能位點，起到調(diào)節(jié)生命活動的功能。如LncRNA“PANDA”可以“誘導(dǎo)”轉(zhuǎn)錄因子NF-YA，以抑制p53 誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用;(2)支架作用(Scaffold):即LncRNA 通過與兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后并起到相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。如LncRNA“HOTAIR”可同時結(jié)合于PRC2(polycomb repressive complex 2)及LSD1/CoREST/REST 形成復(fù)合物，通過基因沉默的方式調(diào)節(jié)H3K27 的甲基化及H3K27me3 的去甲基化［7］;(3)引導(dǎo)作用(Guide):LncRNA 可以募集特定的蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，并通過自身與相應(yīng)基因的特定區(qū)域進行結(jié)合，調(diào)控生命活動。已有相關(guān)研究［8］證明，X 染色體的失活，即基因印記這一經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象與LncRNA 的引導(dǎo)作用有著較為密切的關(guān)系。

目前這三種機制在國內(nèi)外均有相關(guān)研究得以證實［9］。學(xué)界普遍認為LncRNA 有如下兩種功能［10］:(1)表觀遺傳學(xué)水平的基因沉默;(2)調(diào)控基因的剪接。除此之外，LncRNA 還可以起到ceRNA(competingendogenous-RNAs)的作用，即可以競爭性地結(jié)合一部分MicroRNA，解除其對mRNA 的抑制，調(diào)控相應(yīng)的生命活動［11-12］。近來也有文獻報道，LncRNA 還可以與mRNA 相互作用，并促進其穩(wěn)定性［13］。相信隨著研究手段的不斷進步，人類對LncRNA 認識的不斷深入，肯定會有新的功能被不斷發(fā)現(xiàn)。

3 LncRNA 與消化系統(tǒng)腫瘤

LncRNA 現(xiàn)已被證實在基因表達、細胞增殖及分化等各項生命活動中發(fā)揮著重要作用。近年來國內(nèi)外一系列研究均證實LncRNA 在腫瘤細胞中異常表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。本文著重關(guān)注LncRNA 對消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響及其可能的診斷及治療價值。

3.1 LncRNA 與食管癌 食管癌是消化系統(tǒng)最為常見的腫瘤之一，在我國為第二大腫瘤［14］。其起病隱匿，出現(xiàn)癥狀時往往已進入晚期，5 年生存率約為15%～25%，嚴重威脅著人們的生命健康［15］。

Li 等［16］發(fā)現(xiàn)一種主要分布于細胞核中的LncRNA“Linc-POU3F3”，通過募集EZH2(組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶)使PUU3F3 基因啟動子的組蛋白甲基化，而POU3F3 無法翻譯出相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子以發(fā)揮正常的生理作用，最終導(dǎo)致ESCC 的發(fā)生。在食管鱗狀細胞癌細胞株Eca-109 及TE-1 中過表達Linc-POU3F3時，兩者均出現(xiàn)較為明顯的增殖(增殖率分別增加了26% ～37%及14% ～34%);而敲除Linc-POU3F3 后，Eca-109 及TE-1 的增殖則受到了明顯抑制(增殖率分別降低了22% ～30%及24% ～34%)。在ESCC 樣本中，腫瘤組織相對于癌旁組織Linc-POU3F3 呈明顯的高表達。這提示Linc-POU3F3 為ESCC 發(fā)病中的重要分子，其異常的高表達是促進ESCC 發(fā)生及轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)過程，這為未來ESCC 的診斷及個性化治療方案的制定提供了潛在的靶點。

近年來，我國食管腺癌的發(fā)病率在不斷增加，Wu等［17］發(fā)現(xiàn)LncRNA“AFAP1-AS1”在癌組織、癌旁組織及Barrett's 食管組織中表達較正常上皮組織均呈明顯的高表達，通過siRNA 抑制其表達可以使食管腺癌細胞株增殖、侵襲能力明顯下降。

3.2 LncRNA 與胃癌 胃癌［18］是世界范圍內(nèi)致死性第二的惡性腫瘤，每年約有75 萬的新增病例。雖然近幾十年來手術(shù)、放化療等綜合治療技術(shù)快速發(fā)展，但胃癌患者整體療效并無顯著改善，尤其是進展期胃癌預(yù)后更差，其5 年生存率低于25%［19］。因缺少敏感、特異的生物學(xué)標記，且胃癌發(fā)病初期并無明顯的特異性癥狀，患者就診時常常已進入較晚階段。時至今日，胃癌的發(fā)病機制尚未明確。隨著表觀遺傳學(xué)在腫瘤研究中的不斷深入，尤其是與LncRNA 相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA 在各類胃癌細胞中異常表達，提示LncRNA或許可以成為胃癌潛在的臨床標志物。

Wang 等［20］發(fā)現(xiàn)，在既往研究中已被證實與肺癌的增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的LncRNA“MALAT1”，在胃癌的各類細胞株中(SGC-7901、MKN-45、SUN-16)也呈異常高表達。其還可以引起SF2/ASF 蛋白在胃癌細胞核中的募集，而SF2/ASF 在一些炎癥疾病和腫瘤發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。在SGC-7901 細胞株中將MALA-T1 或SF2/ASF 敲除，均會導(dǎo)致該細胞株內(nèi)的細胞周期聚集在G0/G1期，使腫瘤細胞的增殖受到明顯抑制。同時，當(dāng)MALAT1 敲除時，SF2/ASF 的表達及在細胞中的分布均會受到明顯的抑制。然而，當(dāng)敲除MALAT1后過表達SF2/ASF 并不能解除胃癌細胞的增殖抑制。這提示MALAT1 在胃癌的發(fā)病中起到了關(guān)鍵作用，而通過募集SF2/ASF 蛋白來促進腫瘤細胞增殖或許只是其中一條比較重要的通路。因此，MALAT1 可能為胃癌潛在的生物學(xué)標記，針對MALAT1 的基因治療或許可以有效提高胃癌患者的生存率。而Yang 等［21］表明LncRNA-GHET1 在胃癌細胞中呈明顯的高表達，且GHET1 的表達水平與腫瘤的大小、腫瘤的侵襲能力及較差的生存期均有相關(guān)性。功能獲得型模型(gain-offunction)及功能缺失型模型(loss-of-function)分析表明，在體內(nèi)及體外模型中過表達的GHET1 均可以提高胃癌細胞的增殖。而將GHET1 敲除后，胃癌細胞的增殖則會受到明顯的抑制。Pull-Down 實驗及RNA 免疫沉淀(immunoprecipitation)實驗顯示該LncRNA 與胰島素生長因子2-mRNA 結(jié)合蛋白1(IGF2BP1)相結(jié)合，而GHET1 的表達還可以加強IGF2BP1 與c-Myc mRNA 之間的聯(lián)系，并以此提高c-Myc mRNA 量及其表達水平。此外，GHET1 及c-Myc 的表達水平與胃癌的發(fā)生也有著密切的聯(lián)系，c-Myc 的缺失將會消除GHET1對胃癌細胞增殖的促進作用。因此，我們認為LncRNA-GHET1 的表達能夠明顯提高c-Myc 的表達水平及其mRNA 的數(shù)量，從而在胃癌的進展中起到關(guān)鍵作用。

3.3 LncRNA 與結(jié)直腸癌 結(jié)直腸癌［22］是一種在世界范圍內(nèi)均較為常見的惡性腫瘤，每年大約有100 萬的新發(fā)病例。在發(fā)達國家，其死亡人數(shù)大約占到特殊死亡人數(shù)的33%。然而，各類型結(jié)直腸癌的發(fā)病因素極為復(fù)雜，早期做出明確診斷的難度也較大。

Kogo 等［23］發(fā)現(xiàn)在32 例Ⅳ期伴有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，LncRNA“HOTAIR”在腫瘤細胞中的表達遠高于其癌旁組織;相關(guān)性分析顯示HOT-AIR 的表達程度也與肝轉(zhuǎn)移有較高的相關(guān)性。與此同時，HOTAIR 表達水平較高的患者其預(yù)后情況相對較差。對這32 份樣本進行基因富集分析，發(fā)現(xiàn)HOTAIR 的表達與多梳蛋白2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的復(fù)合物(SUZ12、EZH2、H3K27me3)有直接關(guān)聯(lián)。提示HOTAIR 的表達引起了PRC2 的重新定位，從而增強了結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力。Ge 等［24］近期發(fā)現(xiàn)了一個與人類前列腺癌相關(guān)的LncRNA“PCAT-1”在結(jié)直腸癌細胞中呈高表達，推測其異常的表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生也有一定的關(guān)聯(lián)性。

3.4 LncRNA 與肝癌 肝癌［25］是目前全世界范圍內(nèi)最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，死亡率居高不下，患者就診時常已發(fā)生肝內(nèi)及肝外轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。我國是乙肝大國［26］，而HBV 也是肝癌發(fā)生的獨立危險因素。目前對肝癌相關(guān)LncRNA 的研究較多，HULC、HOTAIR、H19 等均有相關(guān)文獻證明與HCC 的各個階段直接關(guān)聯(lián)。

Yuan 等［11］近期研究中發(fā)現(xiàn)，在肝癌細胞中，由TGF-α 激活的LncRNA-ATB 通過競爭性地結(jié)合mir-200 家族從而上調(diào)ZEB1 及ZEB2 基因的表達，由于ZEB1 及ZEB2 均為上皮間質(zhì)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)過程中的重要分子，而以往的研究已經(jīng)證明了EMT 可以促進腫瘤的侵襲，故LncRNA-ATB的上調(diào)可以通過該機制增強肝癌的侵襲能力。同時，LncRNA-ATB 還可以通過結(jié)合白細胞介素11(IL-11)的mRNA，自分泌誘導(dǎo)IL-11，激活STAT-3 信號通路從而促進轉(zhuǎn)移后的腫瘤細胞的克隆增殖。因此，該研究認為LncRNA-ATB 是調(diào)控肝癌增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一，且其可能為引起肝癌瀑布級聯(lián)效應(yīng)的重要環(huán)節(jié)。作為TGF-α 信號通路中的關(guān)鍵分子，LncRNA-ATB 的發(fā)現(xiàn)及功能研究進一步完善了該通路的分子網(wǎng)絡(luò)和理念，為合理解釋其兩面性(促癌及抑癌)提供了重要的理論依據(jù)。再者，LncRNA-ATB 在肝癌發(fā)病中的重要作用，使其有潛力成為未來基因靶向治療腫瘤的關(guān)鍵靶點。

當(dāng)然，LncRNA 在肝癌發(fā)生的各個階段中不僅起促進作用，有一部分LncRNA 同樣起著抑癌作用［27］。Zheng 等［28］研究表明LncRNA-SRHC 在沉默后會促進肝癌細胞的增殖。在使用慢病毒調(diào)控其表達程度的模型中，LncRNA-SRHC 高表達的模型與對照組相比，其細胞增殖受到了明顯的抑制，這提示LncRNA-SRHC可能為一種潛在的抑癌因子。

3.5 LncRNA 與胰腺癌 相對于其他的消化系統(tǒng)腫瘤，LncRNA 在胰腺癌方面的研究較少。Kim 等［29］發(fā)現(xiàn)在36 例胰腺癌患者中，HOTAIR 在腫瘤中的表達水平遠高于其癌旁細胞;在已經(jīng)轉(zhuǎn)移的胰腺癌細胞中的表達水平也高于原發(fā)灶。Kaplan-Meier 生存分析也顯示，低表達HOTAIR 的胰腺癌患者其生存期較高表達患者顯著增長。通過基因富集分析(GSEA)，研究者發(fā)現(xiàn)HOTAIR 在Panc-1 細胞(一類低分化的，具有高度侵襲能力的胰腺癌細胞株)也呈明顯的高表達。這提示，HOTAIR 的表達水平在判斷胰腺癌是否轉(zhuǎn)移、臨床分期及預(yù)后上均有一定的指導(dǎo)意義。近來，也有相關(guān)文獻報道高表達的LncRNA“MALAT1”與胰腺癌的預(yù)后不良有一定的關(guān)系［30］。

迄今為止，LncRNA 在人類生命活動中所扮演的重要角色正被人們不斷地認識，其與各類型腫瘤的相關(guān)研究正逐漸成為當(dāng)代生命科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域。隨著后基因組時代的到來，人類對LncRNA 的研究將為中心法則進一步完善提供重要的理論依據(jù)。消化系統(tǒng)腫瘤在臨床上常見，起病隱匿，并發(fā)癥多，進展快，預(yù)后差。腫瘤是多因素、多環(huán)節(jié)及多基因共同作用的結(jié)果。目前對于LncRNA 與腫瘤的相關(guān)研究主要是以某一特定LncRNA 在腫瘤細胞中的異常表達為切入點，進而從基因表達調(diào)控的角度對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及轉(zhuǎn)移等方面進行研究。但受困于技術(shù)手段，通常局限于某一種LncRNA 對特定腫瘤的影響，而鮮有深入探討其具體的作用機理及是否通過多種LncRNA 的共同作用，人們對LncRNA 的了解還十分有限。不過可以預(yù)見的是，隨著技術(shù)手段的不斷提高，必然會有新的LncRNA 被不斷發(fā)掘出來，通過闡明其與消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的相關(guān)機制，LncRNA 有望被應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤的診斷、分期分級、靶向治療及預(yù)后判斷之中。展望LncRNA 的未來，學(xué)界或許會發(fā)現(xiàn)家族性的LncRNA，并建立LncRNA 研究的系統(tǒng)模型，描繪出由LncRNA調(diào)控基因表達的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)圖譜，從而為腫瘤的診斷及個性化治療提供重要的理論依據(jù)。在后基因時代，LncRNA 極有潛力成為人類攻克腫瘤疾病的重要手段。

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