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·綜述·

Lgr5與卵巢癌關(guān)系的研究進(jìn)展

李婭茹(綜述)，馮玉珍(審校)(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051)

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤；受體，G-蛋白偶聯(lián)；綜述文獻(xiàn)

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.036

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌列居第3位，但致死率卻居首位。由于其位于盆腔深部，早期無明顯臨床表現(xiàn)，而且缺乏有效的診斷依據(jù)，所以約80%患者到晚期才能確診。早期卵巢癌患者經(jīng)有效治療5年生存率超過90%，而晚期卵巢癌患者由于化療耐受和復(fù)發(fā)，5年生存率僅在30%左右，嚴(yán)重危害女性的生命和健康，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。腫瘤干細(xì)胞假說是新近發(fā)展起來的理論，認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有自我更新及多分化潛能的干細(xì)胞樣細(xì)胞，可能源于正常干/祖細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，雖然占腫瘤組織的極少數(shù)，卻是腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根源。目前研究學(xué)者從生物學(xué)特性和功能等方面驗證了腫瘤干細(xì)胞的存在。富含亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)是Wnt/β-catenin信號通路的靶基因，在多種腫瘤中過表達(dá)，為潛在的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。卵巢和輸卵管中Lgr5陽性干細(xì)胞可能是卵巢癌起源的關(guān)鍵細(xì)胞，在卵巢癌中廣泛表達(dá)，與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?，F(xiàn)就Lgr5與卵巢癌關(guān)系的研究進(jìn)展綜述如下。

1Lgr5的生物學(xué)特性

Lgr5是參與信號傳導(dǎo)的細(xì)胞表面分子，是新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質(zhì)亞家族的成員，該亞家族中Lgr4、Lgr5和Lgr6的關(guān)系密切，它們的胞外區(qū)含13～18個富含亮氨酸的重復(fù)序列，Lgr4、Lgr5、Lgr6基因首先從卵泡刺激素、黃體生成素和促甲狀腺激素等糖蛋白激素受體家族的同源物中被篩選出來。人類Lgr5基因長約144 kb，位于染色體12q22～23[1]，其編碼的Lgr5蛋白的外功能區(qū)含17個富含亮氨酸重復(fù)序列，7次α螺旋跨膜區(qū)高度保守。Lgr5在大腦、眼睛、毛囊、乳腺、胃腸道及生殖器官等多種正常組織中表達(dá)，最初因未發(fā)現(xiàn)其生理性配體而被稱為孤兒受體，最近才發(fā)現(xiàn)R-脊椎蛋白(R-spondins，RSPOs)是其內(nèi)源性配體，與Lgr5、卷曲脂蛋白受體相關(guān)蛋白5和6結(jié)合形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，可增強(qiáng)Wnt/β-catenin通路信號，在干細(xì)胞自我更新等過程中起重要作用[2]。

2Lgr5與卵巢干細(xì)胞

卵巢表面上皮(ovarian surface epithelium，OSE)因周期性排卵而發(fā)生破裂和重塑，但對其維持動態(tài)平衡的機(jī)制知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞可以驅(qū)動多種組織上皮的動態(tài)平衡[3-4]，但尚未在卵巢中被證實。研究發(fā)現(xiàn)，排列在排卵卵泡和輸卵管傘邊緣上皮的一些細(xì)胞，表現(xiàn)出干細(xì)胞特性[5-6]。然而，對于這些上皮細(xì)胞亞群的干細(xì)胞功能沒有正式的論證。Lgr5已被證實為胃、腎臟和乳腺等組織的干細(xì)胞標(biāo)記物[5-6]。

Ng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Lgr5最早出現(xiàn)在胚胎第13.5天，在卵巢器官形成中廣泛表達(dá)，出生后表達(dá)逐漸限制在OSE，成年后表達(dá)主要限制在OSE增殖區(qū)和卵巢系膜-輸卵管傘交界上皮；重要的是，在非排卵區(qū)分裂細(xì)胞中Lgr5陽性細(xì)胞比例很低，而在排卵區(qū)Lgr5陽性細(xì)胞比例明顯增高(約50%)，推測Lgr5陽性細(xì)胞可能參與了排卵后組織修復(fù)。隨后長期追蹤LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠，隨訪標(biāo)記LacZ的Lgr5陽性細(xì)胞的后代，結(jié)果顯示胚胎和新生鼠仔LacZ陽性克隆擴(kuò)增并最終促成了OSE細(xì)胞譜系、卵巢系膜韌帶和輸卵管上皮；此外，報告基因活性在成體組織中長期維持，最大克隆總是位于排卵卵泡周圍或修復(fù)的上皮區(qū)域，表明成體Lgr5陽性細(xì)胞群維持OSE平衡和排卵后再生修復(fù)；還發(fā)現(xiàn)Lgr5陽性細(xì)胞具有自我更新和生成不同表型細(xì)胞類型的能力，認(rèn)為Lgr5可作為卵巢和輸卵管上皮干/祖細(xì)胞的標(biāo)記物。然而，F(xiàn)lesken-Nikitin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，這些Lgr5陽性干細(xì)胞定位于卵巢門(即OSE、間皮和輸卵管上皮的交界處)，在排卵后增殖增強(qiáng)，并通過自我更新修復(fù)排卵后受損的卵巢部位；隨后將敲除了抑癌基因Trp53和Rb1的卵巢門干細(xì)胞注入到8只小鼠腹腔，其中7只發(fā)展為高級別漿液性癌，并有5只發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，可能是卵巢癌的起源。這些研究結(jié)果也許還與臨床相關(guān)，因為OSE和輸卵管上皮被認(rèn)為是卵巢癌的起源，而卵巢門為組織的交界性區(qū)域，因此卵巢和輸卵管中Lgr5陽性干細(xì)胞可能是卵巢癌的起源細(xì)胞。

3Lgr5在卵巢癌中的表達(dá)、定位

Lgr5在結(jié)腸、直腸、胃和皮膚等[9-11]多種腫瘤中均過表達(dá)。

翟穎仙等[12]通過免疫組織化學(xué)分析了33例卵巢漿液性乳頭狀腺癌、6例卵巢漿液性囊腺瘤和6例正常卵巢組織中Lgr5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Lgr5主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)；Lgr5在正常卵巢的上皮、卵泡細(xì)胞、血管壁、間質(zhì)以及腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，但它在卵巢囊腺瘤組織中的表達(dá)陽性率與正常卵巢組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在囊腺癌組織中的表達(dá)卻顯著高于以上卵巢囊腺瘤組織和正常卵巢組織；此外，卵巢囊腺癌組織中Lgr5的表達(dá)率從高分化到低分化也逐漸升高。Amsterdam等[13]通過免疫組織化學(xué)法分析了11例絕經(jīng)后婦女正常卵巢組織、12例交界性卵巢腫瘤組織和12例卵巢漿液性癌組織(Ⅱ期)中Lgr5的表達(dá)，結(jié)果顯示在正常卵巢組織中Lgr5主要定位于上皮細(xì)胞胞漿，在交界性腫瘤和卵巢漿液性癌中Lgr5主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿。費夢等[14]通過甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法分析了各種卵巢組織中Lgr5啟動子DNA甲基化情況，發(fā)現(xiàn)Lgr5甲基化與上皮性卵巢癌的分化程度、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，也可作為判斷上皮性卵巢癌患者總預(yù)后的指標(biāo)之一。以上的研究均表明，Lgr5的表達(dá)與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

4卵巢癌干細(xì)胞的分離和鑒定

研究卵巢癌的腫瘤干細(xì)胞，首先要對其進(jìn)行分離和鑒定。由于腫瘤干細(xì)胞數(shù)量極少，缺乏明確的形態(tài)學(xué)特征，目前主要依賴其功能學(xué)特性或表面標(biāo)記進(jìn)行分離。主要有以下3種方法[15]：①無血清懸浮培養(yǎng)法，卵巢癌組織或腹腔積液中的腫瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中形成腫瘤細(xì)胞球，異體移植后可形成腫瘤；②SP細(xì)胞分選法，SP細(xì)胞可將細(xì)胞內(nèi)Hoechst33342等熒光染料泵出細(xì)胞而在顯微鏡下不著色或淺著色，結(jié)合熒光活化細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS)可將SP細(xì)胞分離出來，并隨后證實其具備自我更新、多分化潛能及表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因等腫瘤干細(xì)胞特性；③表型標(biāo)記篩選法，腫瘤干細(xì)胞假說認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞源于正常干細(xì)胞的突變，因此與正常干細(xì)胞有相似的細(xì)胞表面標(biāo)記，通過抗原-抗體反應(yīng)的免疫分選技術(shù)[如FACS、磁性細(xì)胞分選技術(shù)(magnetic actived cell soring,MACS)]實現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的分離。以上3種方法均有一定的局限性：無血清懸浮培養(yǎng)法和SP細(xì)胞分選法不能直接分離Lgr5陽性卵巢癌干細(xì)胞，只能富集包含Lgr5陽性細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞。應(yīng)用腫瘤干細(xì)胞的表型標(biāo)記篩選既簡單又直觀，而卵巢癌的病理類型多、異質(zhì)性強(qiáng)，且對正常卵巢組織干細(xì)胞的研究較少，故尋找卵巢癌干細(xì)胞的特異標(biāo)記更加困難。近年來，卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)記的研究主要借鑒于其他實體腫瘤，研究較廣泛的有CD133、CD117、CD44、ALDH1、ABCG2、Lgr5等。Lgr5是一個7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，由于現(xiàn)有抗體對Lgr5抗原表位的識別不同，導(dǎo)致其在細(xì)胞的定位不同。要通過FACS和MACS分離Lgr5陽性卵巢癌干細(xì)胞，需要該抗體能識別Lgr5的胞外部分。

由于無法從形態(tài)學(xué)上來辨別卵巢癌干細(xì)胞，因此只能根據(jù)其致瘤性、化療耐藥性等干細(xì)胞特性進(jìn)行鑒定。目前鑒別腫瘤干細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”為體外增殖實驗和異種移植成瘤實驗。盡管此方法篩選出的“干細(xì)胞樣細(xì)胞”具備腫瘤干細(xì)胞的特性，但體外實驗始終無法模擬人體內(nèi)復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境和轉(zhuǎn)移特性；甚至有研究發(fā)現(xiàn)，很多不具備干細(xì)胞特性的細(xì)胞在異種移植后也具有致瘤性[16]。因此，該方法用于鑒定卵巢癌干細(xì)胞有一定的局限性，還需要進(jìn)一步改進(jìn)實驗的條件和方法，分析體內(nèi)外的差異，尋找特異性標(biāo)記物，這有助于全面認(rèn)識卵巢癌干細(xì)胞的特性。

5小結(jié)與展望

綜上所述，卵巢癌是一種異質(zhì)性強(qiáng)的腫瘤，卵巢癌干細(xì)胞可能參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。雖然致力于分離、鑒定卵巢癌干細(xì)胞的研究很多，但對于卵巢癌組織中Lgr5的研究還比較少，Lgr5在卵巢腫瘤中表達(dá)，Lgr5陽性腫瘤細(xì)胞是否代表了腫瘤干細(xì)胞，還需要通過細(xì)胞分離和異種移植方法來證實，但這些方法還需要改進(jìn)。當(dāng)前很多藥物為G蛋白偶聯(lián)受體激動劑或拮抗劑，因此Lgr5有可能成為卵巢癌治療的靶點。如果我們能夠明白控制Lgr5陽性細(xì)胞增殖的信號，干預(yù)治療可能將改變卵巢癌可怕的預(yù)后。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Nakata S,Phillips E,Goidts V.Emerging role for leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptors LGR5 and LGR4 in cancer stem cells[J].Cancer Manag Res,2014,6:171-180.

[2]de Lau W,Barker N,Low TY,et al.Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling[J].Nature,2011,476(7360):293-297.

[3]Barker N,Rookmaaker MB,Kujala P,et al.Lgr5(+ve) stem/progenitor cells contribute to nephron formation during kidney development[J].Cell Rep,2012,2(3):540-552.

[4]Plaks V,Brenot A,Lawson DA,et al.LGR5-expressing cells are sufficient and necessary for postnatal mammary gland organogenesis[J].Cell Rep,2013,3(1):70-78.

[5]Paik DY,Janzen DM,Schafenacker AM,et al.Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube:a site for injury and serous cancer initiation[J].Stem Cells,2012,30(11):2487-2497.

[6]Gamwell LF,Collins O,Vanderhyden BC.The mouse ovarian surface epithelium contains a population of LY6A(SCA-1) expressing progenitor cells that are regulated by ovulation-associated factors[J].Biol Reprod,2012,87(4):80.

[7]Ng A,Tan S,Singh G,et al.Lgr5 marks stem/progenitor cells in ovary and tubal epithelia[J].Nat Cell Biol,2014,16(8):745-757.

[8]Flesken-Nikitin A,Hwang CI,Cheng CY,et al.Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche[J].Nature,2013,495(7440):241-245.

[9]He S,Zhou H,Zhu X,et al.Expression of Lgr5,a marker of intestinal stem cells,in colorectal cancer and its clinicopathological significance[J].Biomed Pharmacother,2014,68(5):507-513.

[10]Xi HQ,Cui JX,Shen WS,et al.Increased expression of Lgr5 is associated with chemothera py resistance in human gastric cancer[J].Oncol Rep,2014,32(1):181-188.

[11]Liu S,Gong Z,Chen M,et al.Lgr5-positive cells are cancer stem cells in skin squamous cell carcinoma[J].Tumour Biol,2014,35(11):11605-11612.

[12]翟穎仙,張麗紅,周莉,等.腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)GR5和CD133在卵巢癌中的表達(dá)和意義[J].中國實驗診斷學(xué),2013,17(9):1598-1601.

[13]Amsterdam A,Raanan C,Schreiber L,et al.Localization of the stem cell markers LGR5 and Nanog in the normal and the cancerous human ovary and their inter-relationship[J].Acta Histochem,2013,115(4):330-338.

[14]費夢,張傳宏.lgr5啟動子甲基化在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義[J].長江大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012,9(10):6-8.

[15]楊柳,喬杰,郭紅燕.卵巢癌腫瘤干細(xì)胞分離鑒定方法的進(jìn)展[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2013,22(9):759-761.

[16]Nguyen LV,Vanner R,Dirks P,et al.Cancer stem cells:an evolving concept[J].Nature Reviews Cancer,2012,12(2):133-143.

(本文編輯：趙麗潔)

[中圖分類號]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)12-1486-03

[作者簡介]李婭茹(1988-)，女，河北衡水人，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。

[收稿日期]2015-03-09；[修回日期]2015-04-19