周必英，劉美辰，楊鳳嬌

豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗不同保存條件下的穩(wěn)定性研究

周必英，劉美辰，楊鳳嬌

目的 研究豬帶絳蟲TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重組雙歧桿菌(Bb)疫苗在不同保存條件下的穩(wěn)定性。方法 分別將豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電轉(zhuǎn)入長雙歧桿菌(B.longum)，獲得陽性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum，分別置于不同條件下保存，取出菌液，抽提質(zhì)粒，電泳檢測，進行穩(wěn)定性分析。結(jié)果 陽性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分別在常溫下、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃(液氮中)分別保存48 h、1周、1月、2月，抽提質(zhì)粒，電泳發(fā)現(xiàn)陽性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在液氮中、-80 ℃、-20 ℃中比較穩(wěn)定，而在普通的室溫環(huán)境下，很快發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。結(jié)論 豬帶絳蟲TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因的重組Bb疫苗低溫保存最穩(wěn)定，常溫最差，這為豬帶絳蟲重組Bb疫苗的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

豬帶絳蟲；重組雙歧桿菌疫苗；保存；穩(wěn)定性

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160206), the Grant program of Education Department of Guizhou Province (No. 2010040), and the Dr. Start-up Fund of Zunyi Medical College (No. ZMKD2013-016)

豬囊尾蚴病是由豬帶絳蟲(Taeniasolium) 的中絳期幼蟲豬囊尾蚴寄生于人或豬等引起的一種嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的人獸共患寄生蟲病。我國是高發(fā)國家之一，豬囊尾蚴可寄生于人體皮下、肌肉、腦、眼等不同部位，其中腦囊蟲病致殘率、致死率均較高。該病防治存在化學藥物的殘留和抗藥性問題，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，研制疫苗防治該病已成為當前研究的熱點[1-4]。TSO45W-4B和TSOL18是豬帶絳蟲六鉤蚴階段特異性表達抗原，具有良好的免疫原性和免疫保護性，是理想的豬帶絳蟲疫苗候選抗原[5-7]。重組活載體疫苗是指將編碼外源性抗原的基因引入特定的疫苗載體，構(gòu)建成能表達相應(yīng)抗原而且傳遞至宿主免疫系統(tǒng)引起相應(yīng)免疫應(yīng)答的疫苗。雙歧桿菌(Bifidobacterium,Bb)是人和哺乳動物腸道重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，選擇具有益生功能的Bb作為載體傳遞系統(tǒng)，已在細菌、病毒、寄生蟲、腫瘤等領(lǐng)域構(gòu)建了一系列重組雙歧桿菌[8]。而在豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗穩(wěn)定性研究方面，尚未見相關(guān)報道，因此，本研究擬分別使用豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化長雙歧桿菌Bifidobacterialongum(B.longum)，將獲得的陽性菌株分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質(zhì)粒，電泳鑒定，檢測菌株質(zhì)粒是否丟失，從而判斷其穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種 豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18由本課題組構(gòu)建保存[9-11]；長雙歧桿菌(B.longum)購自美國菌種典藏中心。

1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自美國Axygen公司；MRS培養(yǎng)基購自美國Difico公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。核酸電泳裝置購自北京六一儀器廠；PCR 儀購自美國 MJ-Research公司；厭氧發(fā)生器購自法國梅里埃公司。

1.3 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化B.longum分別將重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL181μg與B.longum感受態(tài)細菌100 μL混勻，冰浴10～15 min后轉(zhuǎn)移至1 mm的電擊杯中，電擊參數(shù)設(shè)置為：電壓1.25 kV、場強12.5 kV/cm、電容25 μF、電阻200 Ω、轉(zhuǎn)化時間5 ms；電擊完畢后立即將混合液轉(zhuǎn)入到900 μL MRS液體培養(yǎng)基的EP管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h；將菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h。

1.4 陽性菌株的PCR鑒定 挑取上述平板中單個菌落至1 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的MRS液體培養(yǎng)基的EP管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～72 h；將菌液4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入250 μL 25%蔗糖溶液重溶菌體沉淀，37 ℃溫浴30 min，期間每隔5 min振蕩1次，使其充分反應(yīng)；抽提質(zhì)粒為模板，進行PCR鑒定。依據(jù)插入基因兩端載體上的序列設(shè)計引物如下：上游引物為P1(5′-TGGCGACCATCCTCCAAAATC-3′)，下游引物為P2(5′-TTCACCGTCATCACCGAAACG-3′)；PCR反應(yīng)體系：上、下游引物各 1 μL，抽提的質(zhì)粒為模板 5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4μL，MgCl24 μL，TaqDNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 29.5 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)擴增30次，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 陽性菌株不同保存條件下的穩(wěn)定性 將上述鑒定的陽性菌株分別置于常溫下、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃(液氮中)保存，分別在48 h、1周、1月、2月后取出保存的菌液，抽提質(zhì)粒，電泳鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 陽性菌株的PCR鑒定 分別以從具有氨芐青霉素抗性的B.longum中抽提的重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18為模板，P1、P2為引物進行PCR擴增可得到450 bp、492 bp和888 bp的基因片段，除去載體序列99 bp，TSO45W-4B基因、TSOL18基因和TSO45W-4B-TSOL18融合基因?qū)嶋H的長度分別為351 bp、393 bp和789 bp，與預期結(jié)果相符，圖1(A～C)。

M: Marker; A1-8: PCR product of the recombinant plasmid pGEX-TSO45W-4B inB.longum; B1-9: PCR product of the recombinant plasmid pGEX-TSOL18 inB.longum; C1-7: PCR product of the recombinant plasmid pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 inB.longum.

圖1 豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗(A-C)的PCR鑒定

Fig.1 Identification of PCR of the recombinantBifidobacteriumvaccine ofTaeniasolium(A-C)

2.2 陽性菌株不同保存條件下的穩(wěn)定性 取出不同保存條件下的菌液，抽提質(zhì)粒，電泳發(fā)現(xiàn)菌株在液氮中、-80 ℃、-20 ℃中比較穩(wěn)定，保存2個月也未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失，而在普通的室溫環(huán)境下，在保存1個月后就開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，圖2(A～E)。

(A) M：Marker；1～8：The plasmid pGEX-TSO45W-4B inB.longum；9～17：The plasmid pGEX-TSOL18 inB.longum；18～24：The plasmid pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 inB.longum. (B～E) M：Marker；1～5：The plasmid pGEX-TSO45W-4B inB.longumat RT,4 ℃,-20 ℃,-80 ℃,-196 ℃；6～10：The plasmid pGEX-TSOL18 inB.longumat RT,4 ℃,-20 ℃,-80 ℃,-196 ℃；11～15：The plasmid pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 inB.longumat RT,4 ℃,-20 ℃,-80 ℃,-196 ℃.

圖2 豬帶絳蟲重組雙歧桿菌疫苗不同保存條件下的穩(wěn)定性(A～E)

Fig.2 Stability of recombinantBifidobacteriumvaccineofTaeniasoliumunder different preservation conditions(A～E)

3 討 論

重組Bb疫苗是一種新型疫苗，具有許多優(yōu)點：所表達的靶抗原不需純化，可直接用于免疫接種，免去了蛋白質(zhì)后處理的復雜工序；單次接種即可誘導機體產(chǎn)生針對靶抗原的免疫反應(yīng)；運用分子生物學手段，通過對不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；可定殖腸道，發(fā)揮益生菌和外源基因雙重功能，達到一劑多用的目的；可作為食品添加劑，制作出風味可口的酸奶品牌，極具開發(fā)價值；對抗生素非常敏感，小劑量即可殺滅該菌。因此，構(gòu)建豬帶絳蟲的重組Bb疫苗，可能是預防和控制豬囊尾蚴病較為安全、有效的一種新型疫苗, 具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，疫苗的穩(wěn)定性是考核疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵，直接關(guān)系到疫苗的質(zhì)量及生產(chǎn)成本。疫苗穩(wěn)定性研究的目的是為證明疫苗產(chǎn)品在某種保存條件下，保存某一段時間后仍然具備可接受的質(zhì)量、有效性和安全性提供科學依據(jù)[12-13]。為此，有必要對重組Bb疫苗進行穩(wěn)定性觀察。

本研究分別將豬帶絳蟲重組質(zhì)粒pGEX-TSO45W-4B、pGEX-TSOL18和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電穿孔轉(zhuǎn)化B.longum，將獲得的陽性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum分別放置不同溫度不同時間后，取出保存的菌液，抽提質(zhì)粒，電泳鑒定，對菌株的穩(wěn)定性進行了試驗研究。結(jié)果表明，陽性菌株pGEX-TSO45W-4B/B.longum、pGEX-TSOL18/B.longum和pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum在常溫下、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196℃(液氮中)保存48 h、1周、1月、2月，菌株穩(wěn)定性不一致，在液氮中、-80 ℃、-20 ℃中比較穩(wěn)定，保存2個月也未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失，而在普通的室溫環(huán)境下，在保存1個月后就開始出現(xiàn)質(zhì)粒丟失現(xiàn)象，表明本研究構(gòu)建的豬帶絳蟲重組Bb疫苗低溫保存能較好保留其遺傳穩(wěn)定性。就不同保存條件下對豬帶絳蟲重組Bb疫苗的基因表達及免疫效力有無影響還有待進一步研究。

[1]Ito A, Urbani C,Jiamin Q, et al. Control of echinococcosis and cysticercosis: a public health challenge to international cooperation in China[J]. Acta Tropica, 2003, 86(1): 3-17.

[2]Xu AJ, Gu JC. The current situation and the prevalent trend of cysticercosis in China[J]. Chin Trop Med, 2010, 10(2): 239-240. (in Chinese) 徐安健,谷俊朝.中國囊蟲病現(xiàn)狀分析及流行趨勢[J].中國熱帶醫(yī)學,2010,10(2):239-240.

[3]Yang YJ, Zhen TM, Kong QA. Advanced on the study of medication for cysticercosis[J]. Chin J Pathogen Biol, 2008, 3(9): 704-707. (in Chinese) 楊艷君,甄天民,孔慶安.囊蟲病的藥物治療研究進展[J].中國病原生物學雜志,2008,3(9):704-707.

[4]Liu MC, He LF, Zhou BY. Research progress on genetic engineering vaccines ofTaeniasolium[J].Chin J Endemiol, 2014, 33(2): 233-236. (in Chinese) 劉美辰,賀莉芳,周必英.豬帶絳蟲基因工程疫苗研究進展[J].中華地方病學雜志,2014,33(2):233-236.

[5]Luo XN, Zheng YD, Hou JL, et al. Protection against AsiaticTaeniasoliuminduced by a recombinant 45W-4B protein[J]. Clin Vaccine Immunol, 2009, 16(2): 230-232.

[6]Ding J, Zheng Y, Wang Y, et al. Immune responses to a recombinant attenuatedSalmonellatyphimuriumstrain expressing aTaeniasoliumoncosphere antigen TSOL18[J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2013, 36(1): 17-23.

[7]Zhou BY. Research progress on recombinant antigens ofTaeniasolium[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(4): 418-422. (in Chinese) 周必英.豬帶絳蟲重組抗原研究進展[J].中國人獸共患病學報,2014,30(4):418-422.

[8]Liu MC, He LF, Zhou BY, et al. Advances in the study of recombinantBifidobacterium[J].Chin J Pathogen Biol, 2014, 9(5): 470-472. (in Chinese) 劉美辰,賀莉芳,周必英.重組雙歧桿菌研究進展[J].中國病原生物學雜志,2014,9(5):470-472.

[9]Zhou BY, Zhou L, Liu MC, et al. Expression, purification and preparation of rabbit antiserum of the gene TSOL18 ofTaeniasolium[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(10): 977-980, 985. (in Chinese) 周必英,周泠,劉美辰,等.豬帶絳蟲TSOL18基因的表達、純化和兔抗血清的制備[J].中國人獸共患病學報,2013,29(10):977-980,985.

[10]Zhou BY, Zhou L, Liu MC, et al. Expression and purification of a fusion gene TSO45W-4B-TSOL18 ofTaeniasoliuminEscherichiacoliArctic Express(DE3)and preparation of rabbit antiserum[J]. Chin J Endemiol, 2013, 32(6): 619-624. (in Chinese) 周必英,周泠,劉美辰,等.豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因在大腸埃希菌ArcticExpress(DE3)中的表達、純化和兔抗血清的制備[J].中華地方病學雜志,2013,32(6):619-624.

[11]Zhou BY, Zhou L, Liu MC, et al. Cloning, expression of TSO45W-4B gene fromTaeniasoliumand preparation of its polyclonal antibody[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2013, 31(5): 372-375. (in Chinese) 周必英,周泠,劉美辰,等.豬帶絳蟲TSO45W-4B基因的克隆、表達和抗體制備[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2013,31(5):372-275.

[12]Zhang C, Jiang DC, Huang ZL, et al. Some thoughts on main technical issues arising from vaccine stability study in China[J]. Chin Pharmaceutical Affairs, 2009, 23(4): 349-351. (in Chinese) 張弛,姜典才,黃志祿,等.對我國疫苗穩(wěn)定性研究主要技術(shù)問題的思考[J].中國藥事,2009,23(4):349-351．

[13]Tang YD, Gu ZX, Liu Y, et al. Observation on the stability of the genetic engineering bacteria used to production of the vaccine against swine cysticercosis[J]. Chin J Zoonoses, 2000, 16(3): 66-67. (in Chinese) 唐雨德,顧志香,劉玉,等.豬囊蟲病疫苗生產(chǎn)用工程菌菌種的穩(wěn)定性觀察[J].中國人獸共患病雜志,2000,16(3):66-67.

Stability of recombinantBifidobacteriumvaccine ofTaeniasoliumunder different preservation conditions

ZHOU Bi-ying,LIU Mei-chen,YANG Feng-jiao

(DepartmentofParasitology,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

We studied the stability of the recombinantBifidobacterium(Bb) vaccine ofTaeniasoliumTSO45W-4B gene, TSOL18 gene or TSO45W-4B-TSOL18 fusion gene under different preservation conditions. The recombinant plasmid pGEX-TSO45W-4B, pGEX-TSOL18 or pGEX-TSO45W-4B-TSOL18 ofTaeniasoliumwas transformed intoBifidobacteriumlongum(B.longum) to obtain positive strains pGEX-TSO45W-4B/B.longum, pGEX-TSOL18/B.longumor pGEX-TSO45W-4B-TSOL18/B.longum. At different preservation conditions, the stability of the positive strains was confirmed by electrophoresis of the extracted recombinant plasmid. The positive strains were preserved and the stability of the positive strains was confirmed. With the condition of preservation at room temperature (RT), 4 ℃, -20 ℃, -80 ℃, -196 ℃ (in liquid nitrogen) and for 48 hrs, one week, one month, two months, respectively, the plasmid electrophoresis demonstrated that the positive strains were more stable at -196 ℃, -80 ℃, and -20 ℃ while the plasmid disappeared at RT. It’s indicated that the recombinant Bb vaccine ofTaeniasoliumTSO45W-4B gene, TSOL18 gene or TSO45W-4B-TSOL18 fusion gene were more stable at lower preserved temperature, which laid the foundation for the further study of the recombinant Bb vaccine ofTaeniasolium.

Taeniasolium; recombinantBifidobacteriumvaccine; preservation; stability

國家自然科學基金(81160206)；貴州省教育廳資助項目(黔教科2010040)；遵義醫(yī)學院博士啟動基金(ZMKD2013-016)

遵義醫(yī)學院寄生蟲學教研室, 遵義 563003; Email：zbyzl01@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.011

R383.3

A

1002-2694(2015)07-0645-04

2014-07-18；

2015-03-25