李明宇，安 宇，侯利民(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科，哈爾濱 150001)

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·論 著·

Ⅱ型前膠原羧基末端前肽對骨性關(guān)節(jié)炎早期診斷價值的實驗研究

李明宇，安 宇，侯利民△
(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科，哈爾濱 150001)

目的 通過建立大鼠骨性關(guān)節(jié)炎(OA)模型，研究大鼠血清和關(guān)節(jié)液中Ⅱ型前膠原羧基末端前肽(PⅡCP)水平變化，探討體液PⅡCP對早期OA的診斷價值。方法 將Wistar大鼠隨機(jī)分成OA模型組和假手術(shù)組，用改良Hulth法誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型。分別于造模后1～5周，每周每組抽取6只大鼠取關(guān)節(jié)液、血清及關(guān)節(jié)標(biāo)本，用ELISA檢測體液PⅡCP水平，關(guān)節(jié)軟骨行大體觀察評分和組織病理學(xué)評分。所得數(shù)據(jù)用方差分析比較各時間點兩組間的差異性,比較PⅡCP水平和軟骨評分隨時間的變化規(guī)律，用Pearson相關(guān)系數(shù)和線性回歸分析來檢驗體液PⅡCP水平的相關(guān)性。結(jié)果OA模型組在術(shù)后第1周軟骨組織學(xué)表現(xiàn)接近假手術(shù)組，從第2周開始逐漸出現(xiàn)明顯的OA病理學(xué)改變，假手術(shù)組軟骨組織學(xué)無明顯改變。OA模型組體液PⅡCP水平從術(shù)后第1周開始較假手術(shù)組明顯增高，并隨時間推移差異性逐漸增大；假手術(shù)組體液PⅡCP始終維持在較低水平；血清與關(guān)節(jié)液PⅡCP水平具有良好相關(guān)性。結(jié)論 大鼠OA模型中，血清和關(guān)節(jié)液PⅡCP水平在軟骨出現(xiàn)明顯病理變化之前就已經(jīng)升高，PⅡCP水平與OA病理變化相符合，關(guān)節(jié)液和血清PⅡCP水平可作為OA早期診斷的參考指標(biāo)。

骨性關(guān)節(jié)炎； Ⅱ型前膠原羧基末端前肽； 軟骨； 診斷

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種普遍流行的慢性疾病，是引起中老年人關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的常見原因之一，發(fā)病率高，影響大約40%年齡超過70歲的老年人[1],且隨著老齡化及肥胖人口增多，其發(fā)病率將持續(xù)升高。OA起始階段是隱匿的，癥狀出現(xiàn)時往往已至中晚期，不可逆轉(zhuǎn)，所以如何早期診斷OA成為關(guān)鍵?，F(xiàn)有OA檢查方法如X線片、MRI、關(guān)節(jié)鏡等由于本身缺陷或滯后性而不能早期診斷OA，因此尋找能早期診斷和監(jiān)測病情的生物標(biāo)記物已成為當(dāng)今研究熱點。

當(dāng)OA發(fā)生、發(fā)展時關(guān)節(jié)軟骨最先遭到破壞，軟骨代謝失衡，代謝產(chǎn)物在體液中明顯變化，所以軟骨代謝標(biāo)記物備受關(guān)注。其中Ⅱ型前膠原羧基末端前肽(PⅡCP)是關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原合成過程中的產(chǎn)物，體液PⅡCP水平能反映軟骨分子水平的代謝情況，有研究證實OA患者血清和關(guān)節(jié)液PⅡCP水平高于健康人，且較影像學(xué)更敏感[2]。本實驗旨在通過建立大鼠OA模型，研究OA早期大鼠血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP水平的變化和關(guān)聯(lián)，同時觀測軟骨組織學(xué)變化，探討體液PⅡCP變化對早期OA的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 取清潔級Wistar成年雄性大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，購于吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院，飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物中心。將60只大鼠隨機(jī)分成兩組：OA模型組(30只)，假手術(shù)組(30只)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 采用改良Hulth法即前交叉韌帶切斷術(shù)來誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g行腹腔注射麻醉，在無菌條件下于左膝髕旁內(nèi)側(cè)做縱行切口約1 cm，屈膝狀態(tài)下切斷前交叉韌帶，逐層縫合傷口，待麻醉清醒后放回籠中。假手術(shù)組顯露前交叉韌帶后縫合關(guān)節(jié)囊，其余同模型組。

1.2.2 取材、處理及關(guān)節(jié)軟骨大體評分 于造模后1～5周每周每組隨機(jī)抽取6只大鼠，用心臟穿刺術(shù)采集血液約4 mL，注入血清管；用1 mL注射器吸取0.2 mL 0.9%生理鹽水刺入關(guān)節(jié)腔，進(jìn)行反復(fù)抽吸，將抽吸液注入血清管，記錄稀釋倍數(shù)。室溫放置10 min后，離心機(jī)以3 000 r/min離心20 min，收集上清液于EP管，放入-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。處死大鼠取關(guān)節(jié)標(biāo)本，肉眼觀察軟骨外觀、色澤、邊緣、透明度以及表面有無充血、軟化、裂隙等情況，進(jìn)行大體觀察評分[3]。

1.2.3 關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)檢查 關(guān)節(jié)標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)脫鈣，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅染色(HE)和阿利新藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察軟骨的組織學(xué)特征。病理檢查由兩位病理科專家進(jìn)行，依據(jù)軟骨結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、基質(zhì)染色及潮線完整性進(jìn)行Mankin評分分級[4]：0～1分正常，>1～6分輕度軟骨損傷，>6～10分中度損傷，>10～14分重度損傷。 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D公司)檢測血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP水平，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔吸光度值并計算濃度。關(guān)節(jié)稀釋液PⅡCP濃度乘以稀釋倍數(shù)，得到關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度。

2 結(jié) 果

2.1 關(guān)節(jié)標(biāo)本大體觀察 各時間點假手術(shù)組軟骨表面光滑，色澤明亮，呈淡藍(lán)色。術(shù)后1周，OA模型組軟骨同假手術(shù)組差異不大，大體評分約為0.3分；術(shù)后2周，軟骨色澤稍淡，透亮度減低，約為0.5分；術(shù)后3周，軟骨面灰暗、粗糙，見細(xì)小裂紋，約為1分；術(shù)后4周，軟骨面蒼白，粗糙加重，裂紋較多，出現(xiàn)潰爛，約為2分；術(shù)后5周，內(nèi)外髁面凹凸不平，多個細(xì)小潰爛，未見明顯軟骨剝脫，約為2.5分(圖1)。在不同時間點，比較大體評分(表1)示：OA模型組與假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OA模型組大體評分隨時間變化明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=206.31，P<0.05)。

圖1 各時間點大鼠關(guān)節(jié)軟骨的大體觀

2.2 關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察 各時間點觀察到假手術(shù)組軟骨基質(zhì)呈均勻藍(lán)色，表面無粗糙改變、無裂隙，細(xì)胞無簇集現(xiàn)象。術(shù)后1周，OA模型組軟骨組織學(xué)接近假手術(shù)組；術(shù)后2周，基質(zhì)色澤改變，出現(xiàn)細(xì)胞排列紊亂、簇集；術(shù)后3周，出現(xiàn)粗糙及纖維化改變，基質(zhì)染色不均，細(xì)胞排列紊亂加重，可見軟骨陷窩，潮線基本完整；術(shù)后4周，表面粗糙、裂隙、纖維化，細(xì)胞散在增生及簇集明顯，潮線不清；術(shù)后5周，表層出現(xiàn)缺損區(qū)及潰爛，局部潮線消失，軟骨下骨骨小梁斷裂、鈣化層模糊，阿利新藍(lán)染色部分層次失染(圖2)。在不同時間點，比較Mankin評分(表2)示：OA模型組與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OA模型組Mankin評分隨時間變化明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=309.56，P<0.05)。

2.3 血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP水平 血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度顯示：在各時間點OA模型組血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度與假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3、4。OA模型組血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度隨時間變化明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=250.50，P<0.05)。模型組血清PⅡCP濃度隨著關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度的升高而升高，血清PⅡCP濃度為(8.06±3.13)ng/mL，關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度為(42.21±15.56)ng/mL，兩者相關(guān)分析說明關(guān)節(jié)液和血清PⅡCP水平呈明顯正相關(guān)(r=0.919，P<0.05)，可得出一般線性回歸方程：血清PⅡCP濃度=0.197×關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度-0.239；在各時間點假手術(shù)組血清和關(guān)節(jié)液PⅡCP始終處于較低水平，隨時間變化不明顯(P>0.05)。

表1 術(shù)后不同時間關(guān)節(jié)軟骨的大體觀察評分±s，分)

注：與假手術(shù)組比較,*P<0.05。

注：每周的兩幅圖片中，左邊圖片為HE染色(×100)，右邊圖片為阿利新藍(lán)染色(×40)。

圖2 各時間點大鼠關(guān)節(jié)軟骨的病理學(xué)觀察

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

表3 大鼠血清中PⅡCP濃度變化±s，ng/mL)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

表4 大鼠關(guān)節(jié)液中PⅡCP濃度變化±s，ng/mL)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05。

3 討 論

3.1 大鼠OA模型的建立OA造模方法有多種，最常用的為Hulth法：切斷前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板,造成膝關(guān)節(jié)極不穩(wěn)定，力學(xué)傳導(dǎo)改變，誘導(dǎo)OA模型。Stoop等[5]在不同時間點對大鼠行前交叉韌帶切斷法誘導(dǎo)OA模型，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)變化符合早中期OA的特征。Hayami等[6]研究發(fā)現(xiàn)前交叉韌帶切斷法誘導(dǎo)大鼠OA模型能較好地反映OA的進(jìn)展過程。本實驗采用的是改良Hulth法,即單純切斷前交叉韌帶，此法操作簡單、創(chuàng)傷小,對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變較少，切除前交叉韌帶可使力學(xué)傳導(dǎo)產(chǎn)生改變，可誘發(fā)軟骨退變，能較好地模擬OA病理變化。

本實驗關(guān)節(jié)標(biāo)本大體評分和組織學(xué)評分均與文獻(xiàn)報道基本相符：術(shù)后1周，模型組與假手術(shù)組比較差異不明顯；術(shù)后2周開始出現(xiàn)軟骨色澤改變，細(xì)胞增生及排列紊亂；術(shù)后3周出現(xiàn)軟骨表面粗糙及纖維化，基質(zhì)染色不均，細(xì)胞簇集生長；術(shù)后4周出現(xiàn)軟骨表面裂隙，細(xì)胞簇集生長明顯，排列明顯紊亂；術(shù)后5周軟骨表面潰爛并出現(xiàn)軟骨缺損區(qū)，局部潮線消失。改良Hulth法能較好地復(fù)制OA早中期組織學(xué)特征,比較適合OA發(fā)病機(jī)制和早期診斷方面的研究。

3.2 體液PⅡCP與軟骨損傷和退變的關(guān)系 在正常軟骨中，基質(zhì)合成和分解代謝處于平衡狀態(tài)；當(dāng)OA發(fā)生、發(fā)展時，代謝平衡被打破，代謝速率相應(yīng)加快。PⅡCP是Ⅱ型膠原合成過程中的產(chǎn)物，可在體液中通過免疫法進(jìn)行濃度測定，在無軟骨損傷或退變時體液PⅡCP濃度始終維持在較低水平。因Ⅱ型膠原特異性地表達(dá)在軟骨組織中，所以PⅡCP能特異性地反映軟骨代謝情況。Shinmei等[7]對中等程度膝關(guān)節(jié)OA患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度顯著高于正常對照組，表明關(guān)節(jié)液PⅡCP水平能反映軟骨Ⅱ型膠原的合成功能及軟骨受損程度。Hotta等[8]研究兔OA模型的早期階段PⅡCP關(guān)節(jié)液濃度與mRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明在OA不同階段軟骨合成功能不同，中度OA時軟骨細(xì)胞在退變區(qū)域的合成作用最強(qiáng)，退變加重時合成作用逐漸減低，但可觀察到在OA晚期軟骨修復(fù)仍存在。體液PⅡCP水平變化可反映OA發(fā)展的不同階段。

本實驗建立早期OA模型，通過研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后1周時OA模型組大體評分及病理學(xué)評分均高于假手術(shù)組(P<0.05)，OA模型組血清與關(guān)節(jié)液PⅡCP水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，說明模型組在軟骨出現(xiàn)輕微病理變化時體液PⅡCP水平就已明顯升高；OA模型組在各時間點血清及關(guān)節(jié)液PⅡCP水平均明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，并隨時間推移不斷升高，其差異性與病理表現(xiàn)出的差異性相符，說明早期OA時軟骨損傷逐漸加重，體液PⅡCP水平逐漸升高，表明體液PⅡCP水平能反映關(guān)節(jié)軟骨情況。

3.3 體液PⅡCP與OA病情進(jìn)展的關(guān)系 體液PⅡCP水平可用于預(yù)測OA進(jìn)展。Lohmander等[2]發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)OA患者關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度明顯增加，隨診結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度逐漸升高，1～4年內(nèi)達(dá)到峰值，這時X線片表現(xiàn)出OA改變，隨著OA發(fā)展，軟骨分解大于合成，關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度逐漸下降，監(jiān)測體液PⅡCP水平可作為預(yù)測OA進(jìn)展的指標(biāo)。Sugiyama等[9]對早期OA女性患者進(jìn)行4年隨訪，結(jié)果表明體質(zhì)量指數(shù)與PⅡCP水平輕度正相關(guān)，關(guān)節(jié)間隙狹窄程度與PⅡCP水平呈正相關(guān)，關(guān)節(jié)液PⅡCP水平能預(yù)測早期膝關(guān)節(jié)OA的影像學(xué)進(jìn)展。Cibere等[10]研究發(fā)現(xiàn)高水平血清PⅡCP降低影像學(xué)OA的發(fā)生風(fēng)險。

本實驗從術(shù)后1～5周OA模型組與假手術(shù)組比較，軟骨評分差異均逐漸增大(P<0.05)，逐漸出現(xiàn)軟骨色澤改變、細(xì)胞增生、排列紊亂，到表面凹凸不平、軟骨缺損，符合OA早期組織學(xué)特征，而體液PⅡCP水平隨OA進(jìn)展逐漸升高(P<0.05)，表明體液PⅡCP可用于預(yù)測OA進(jìn)展。

3.4 體液PⅡCP對OA的早期診斷意義OA是普遍發(fā)病的退變性疾病，隨著人口老齡化及肥胖人口增多，此病的發(fā)病率將持續(xù)升高，所產(chǎn)生的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將繼續(xù)增加。由于OA癥狀出現(xiàn)時往往已發(fā)展至中晚期，不可逆轉(zhuǎn)，早期診斷OA至關(guān)重要，現(xiàn)有的檢查方法都是基于軟骨形態(tài)學(xué)變化，敏感性及精確度都欠佳，對早期診斷OA存在滯后性。生物標(biāo)記物能在影像學(xué)變化之前就反映出軟骨代謝改變，且能識別高危人群、反映OA治療效果。

軟骨源性代謝產(chǎn)物能監(jiān)測軟骨合成和降解情況，在代謝過程中代謝產(chǎn)物進(jìn)入體液中，利用生化檢測法可特異性地檢測出濃度，PⅡCP就是滿足要求的生物標(biāo)記物。實驗發(fā)現(xiàn)OA軟骨發(fā)生輕微組織學(xué)變化時，體液PⅡCP水平就已經(jīng)升高，與假手術(shù)組差異顯著。關(guān)節(jié)液PⅡCP濃度明顯高于血清，且與血清PⅡCP具有良好相關(guān)性，提示血清PⅡCP來源于關(guān)節(jié)，而且體液PⅡCP水平隨OA進(jìn)展而逐漸升高，說明體液PⅡCP水平反映OA病理變化過程，可作為OA早期診斷及評價進(jìn)展程度的指標(biāo)。另外本實驗只是檢測一種軟骨生物標(biāo)記物，僅研究體液PⅡCP對大鼠OA的早期診斷價值，有可能忽略其他重要生物標(biāo)記物。有研究報道患者與對照組生物標(biāo)記物水平有重疊部分，表明當(dāng)前研究的生物標(biāo)記物在個體水平上用作診斷工具還不夠敏感，可考慮標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用來提高診斷的精確性。體液PⅡCP與其他標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用提高OA診斷的準(zhǔn)確性，以及PⅡCP對人類OA早期診斷價值的研究還有待進(jìn)一步研究。

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Experimental research of early diagnostic value of C-terminal propeptide of type Ⅱ procollagen for osteoarthritis

LIMing-yu,ANYu,HOULi-min△
(DepartmentofEmergencySurgery,FirstAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin,Heilongjiang150001,China)

Objective To study the diagnostic value of C-terminal propeptide of type Ⅱ procollagen(PⅡCP) in early osteoarthritis(OA) through monitoring the changes of PⅡCP in the synovial fluid and serum of the OA model rat.Methods Wistar rats were randomly divided into the OA model group and the sham operation group.The rat knee-joint OA model was induced by the improved Hulth surgery method.The synovial fluid,serum and joint specimens were weekly taken from 6 rats in each group at 1-5 weeks after modeling,the serum and synovial fluid PⅡCP levels were measured by ELISA.The general observation score and histopathological score of articular cartilage were obtained.The differences at various time points were compared between the two groups and the change rule of PⅡCP levels and cartilage scores with time was compared.The Pearson correlation coefficient and linear regression analysis were adopted to test the correlation between serum and synovial fluid PⅡCP levels.Results The histologic manifestations of cartilage at postoperative 1 week in the OA model group were similar to those in the sham operation group,and the obvious pathologic change gradually started to appear at postoperative 2 weeks.The cartilage histology of the sham operation group had no obvious change.Compared with the sham operation group,the serum and synovial fluid PⅡCP levels in the OA model group started to obviously increase at postoperative 1 week,and the difference was gradually increased with time lapse;the humoral PⅡCP levels of the sham operation group maintained a lower level from beginning to end;the serum PⅡCP level had a good correlation with the synovial fluid PⅡCP level.Conclusion In rat OA model,the serum and synovial fluid PⅡCP levels are increased before the cartilage appears obvious pathological change,and the PⅡCP levels are consistent with the OA pathological change,so the serum and synovial fluid PⅡCP levels could be used as the reference indicators of OA early diagnosis.

osteoarthritis; C-terminal propeptide of type Ⅱ procollagen; cartilage; diagnosis

李明宇，男，醫(yī)師，碩士，主要從事急診創(chuàng)傷及關(guān)節(jié)外科研究?！?/p>

，E-mail：houlimin1969@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.22.019

A

1672-9455(2015)22-3342-03

2015-05-12

2015-09-11)