武 菲 白 波 張秋玲

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪致細(xì)胞凋亡模型的建立*

武 菲1白 波1張秋玲2

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067；2泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

目的 采用簡(jiǎn)便、有效的方法建立體外培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪致凋亡的模型。方法 新生大鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)7d后，全量換液為不含葡萄糖的Earle’s液，并以滅菌液體石蠟封閉。MAP-2熒光染色觀察神經(jīng)元損傷情況，采用LDH和Tunel法檢測(cè)大鼠皮層神經(jīng)元大致死亡和凋亡情況。結(jié)果 隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元損傷加重并發(fā)生凋亡，與對(duì)照組比較有顯著差異。結(jié)論 無糖Earle’s液培養(yǎng)并配合滅菌液體石蠟封閉，可以模擬神經(jīng)元缺血缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

氧糖剝奪；凋亡；模型

神經(jīng)元離體培養(yǎng)在神經(jīng)科學(xué)研究中具有重要價(jià)值和獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，為多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具，體外培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型是模擬缺血性腦卒中的重要手段。我們?cè)谏窠?jīng)元原代培養(yǎng)并純化鑒定的基礎(chǔ)上，制備OGD模型，應(yīng)用微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2) 熒光染色、LDH和Tunel法作為檢測(cè)手段，驗(yàn)證本模型誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的有效性，為缺血性腦卒中的研究提供更方便的凋亡模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生48h內(nèi)的Wistar大鼠，雌雄不限，由泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究室提供。

1.2 藥品與儀器

1.2.1 藥品 DMEM/F12、胎牛血清(HyClone公司)；Neurobasal-A、B27(Gibco公司)；多聚賴氨酸、阿糖胞苷、Hoechst33342(Sigma公司)；胰蛋白酶、D-Hanks液(Solarbio公司)；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶多克隆抗體、小鼠抗微管相關(guān)蛋白-2單克隆抗體、羊抗小鼠IgG/Cy3(武漢博士德公司)；兔SP檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)；LDH檢測(cè)試劑盒(南京建成公司)；小鼠抗NeuN單克隆抗體(Chemicon公司)；DeadEnd FluorometricTUNEL System(Promega公司)。

1.2.2 儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；培養(yǎng)箱(Sanyo公司)；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus公司)。

1.3 OGD模型的建立

1.3.1 新生大鼠皮層神經(jīng)元的分離與培養(yǎng) 新生48h內(nèi)的Wistar大鼠75%乙醇消毒后，斷頭并剝離出全腦，置于預(yù)冷的D-Hanks液中沖洗。解剖顯微鏡下仔細(xì)剝離腦膜和血管，分離出皮層，用眼科剪將皮層剪成1mm3的小塊。將組織塊轉(zhuǎn)移到離心管中，加入0.25%的胰蛋白酶37℃水浴消化30min，每5min振蕩1次。血清終止消化，吹打管吹打，200目濾網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液1000r/min離心5min。棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，混勻后計(jì)數(shù)、接種。置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后4～6h全量換液，于培養(yǎng)第3天加入阿糖胞苷，終濃度為1μmol/L，作用24h后全量換液。之后隔3d半量換液1次。培養(yǎng)至第7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 原代神經(jīng)元鑒定 培養(yǎng)7d的神經(jīng)元棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定，0.3%Triton-X100通透胞膜，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉，滴加濃度為1∶100的神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)，一抗4℃過夜。PBS沖洗，依次滴加生物素化的二抗、辣根酶標(biāo)記的工作液。避光進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染。脫水、透明后晾干，中性樹膠封片觀察。以胞體及突起染成棕黃色者為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5張爬片，每張爬片在200×視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)目，以及蘇木素染色的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.3.3 皮層神經(jīng)元OGD模型的建立 培養(yǎng)第7天的神經(jīng)元棄培養(yǎng)液，無糖Earle’s液沖洗3遍，全量換液為無糖Earle’s液，以滅菌液體石蠟覆蓋，使培養(yǎng)液與空氣隔絕，不斷消耗殘存的氧氣與糖，制造OGD模型。置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察OGD 6、9、12、24、30h細(xì)胞狀態(tài)。正常對(duì)照組繼續(xù)用Neurobasal-A+B27培養(yǎng)液培養(yǎng)，OGD對(duì)照組用含葡萄糖Earle’s液培養(yǎng)。

1.3.4 MAP-2熒光染色 棄培養(yǎng)液，預(yù)溫PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗。0.3%Triton-X100通透胞膜10min，PBS沖洗。5%BSA封閉30min，滴加1∶200 MAP-2一抗4℃過夜。PBS沖洗，滴加1∶100 Cy3標(biāo)記二抗避光室溫孵育30min，PBS沖洗。10μg/ml Hoechst 33342避光染色20min，PBS沖洗。滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 LDH測(cè)定 OGD 6、9、12、24、30h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH測(cè)試試劑盒說明書進(jìn)行LDH測(cè)定。

1.3.6 Tunel染色計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞比例 OGD 12h后，培養(yǎng)細(xì)胞棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，預(yù)冷4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗。0.3%Triton-X100通透胞膜10min，PBS沖洗，5%BSA封閉30min。滴加1∶300 NeuN 4℃過夜。PBS沖洗，滴加1∶100 Cy3標(biāo)記二抗避光室溫孵育30min，PBS沖洗。按照說明書，加入Tunel平衡緩沖液室溫下平衡5～10min。冰上避光配制rTdT反應(yīng)液，每張爬片滴加50μl反應(yīng)液，蓋上塑料蓋玻片，37℃避光孵育1h。2×SSC室溫下終止反應(yīng)15min。10μg/ml Hoechst 33342避光染色15min，去離子水沖洗。滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元生長(zhǎng)及鑒定

接種當(dāng)時(shí)即有少量神經(jīng)元開始貼壁，細(xì)胞圓形，立體感強(qiáng)。接種后4h細(xì)胞大部分貼壁，少量已開始伸出偽足樣突起。培養(yǎng)第1天時(shí)細(xì)胞均已長(zhǎng)出突起，胞體圓形或橢圓形，光暈明顯。第3～4天神經(jīng)元胞體長(zhǎng)大，突起增長(zhǎng)并相互連接成網(wǎng)絡(luò)，以雙極和多極神經(jīng)元為主。第7天神經(jīng)元胞體和突起光暈明顯，突起延長(zhǎng)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)豐滿。經(jīng)NSE免疫組化鑒定，神經(jīng)元比例為(90±6.2)%，為相對(duì)純的培養(yǎng)物，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 OGD對(duì)神經(jīng)元活力的影響

經(jīng)MAP-2染色，正常對(duì)照組神經(jīng)元以雙極和多極為主，胞體呈橢圓、三角形或圓形，胞核大而圓，居于胞體一側(cè)，突起長(zhǎng)而舒展，交互成網(wǎng)(圖1-A)。OGD 6h組神經(jīng)元MAP-2染色略淺，輪廓尚存，突起開始變得迂曲(圖1-B)。OGD 12h組神經(jīng)元MAP-2染色淺而模糊，輪廓不清，結(jié)構(gòu)喪失，殘留部分胞體和突起，殘留突起明顯縮短并呈串珠狀或竹節(jié)狀(圖1-C)。OGD 30h 組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完全喪失，僅殘存極少胞體(圖1-D)。OGD 6、9、12、24、30h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，LDH測(cè)定顯示隨OGD時(shí)間延長(zhǎng)，LDH漏出進(jìn)行性增多并呈時(shí)間依賴，細(xì)胞死亡增多，見表1。

圖1 不同組別的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(MAP-2染色 ×400)

表1 OGD對(duì)體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH濃度的影響

2.3 OGD的凋亡效應(yīng)

根據(jù)Tunel綠色熒光占Hoechst 33342的比例計(jì)算Tunel陽性神經(jīng)元的比例，與OGD對(duì)照組相比，OGD 9、12、24、30h組均有顯著性差異(P<0.01)，且OGD 12h組凋亡率明顯高于其他組(P<0.05)(表2)。以Tunel及神經(jīng)元特異性核蛋白(Neuron-specific nuclear protein,NeuN)染色神經(jīng)元，結(jié)果顯示正常情況下皮層神經(jīng)元NeuN染色較深，Tunel陽性細(xì)胞極少(圖2-A)，OGD損傷12h后NeuN陽性細(xì)胞減少且染色變淺，而Tunel陽性細(xì)胞增多(圖2-B)。繼續(xù)延長(zhǎng)OGD損傷時(shí)間至24h Tunel陽性細(xì)胞反而減少(圖2-C)。

表2 Tunel陽性神經(jīng)元比例(%)

圖2 不同組別神經(jīng)元細(xì)胞凋亡形態(tài)(Tunel染色×400)

3 討論

缺血性腦卒中是人類致死致殘最常見的疾病之一，盡管近年來醫(yī)學(xué)工作者在該領(lǐng)域做了大量基礎(chǔ)與臨床工作，但仍沒找到能夠有效控制腦卒中產(chǎn)生的神經(jīng)組織損傷和功能缺失的有效手段。腦缺血后神經(jīng)損傷既有壞死又有凋亡，凋亡在腦缺血損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，在梗死形成過程中同樣發(fā)揮重要作用[1-2]。

為了更好地研究腦缺血的機(jī)制，研發(fā)神經(jīng)保護(hù)措施和藥物，國內(nèi)外科研工作者已研究出了大量的在體及離體模型[3]。離體模型較在體模型能更清晰地在細(xì)胞和分子水平反映損傷機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，而且避免了在體模型中神經(jīng)體液等干擾因素的影響[4]。離體模型包括“化學(xué)性”缺血模型，谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性毒性模型，以及氧糖剝奪模型[5]。其中，模擬腦缺血氧糖供應(yīng)中斷最可靠、最常用的方法是氧糖剝奪[6]，方法包括采用氮?dú)夂投趸蓟旌蠚怏w培養(yǎng)或者培養(yǎng)物沒入充溢氮?dú)獾牟缓桥囵B(yǎng)液[7-8]。

本實(shí)驗(yàn)采用無糖Earle’s液全量置換含糖培養(yǎng)液，并覆蓋滅菌液體石蠟隔離氧氣制備OGD模型，使培養(yǎng)液與外界氣體隔絕，不斷消耗培養(yǎng)液中殘存的氧氣與糖，模擬缺血缺氧狀態(tài)。此模型制備較三氣培養(yǎng)箱、缺氧小室等方法更簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)，不需特殊設(shè)備，可重復(fù)性強(qiáng)。MAP-2大量表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)及突觸中，MAP-2免疫細(xì)胞化學(xué)染色可清晰顯示神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整性[9]，OGD后經(jīng)MAP-2熒光染色可見神經(jīng)元損傷明顯。LDH正常情況下存在于胞質(zhì)中，僅在細(xì)胞損傷胞膜破裂時(shí)漏出胞外[10]，本實(shí)驗(yàn)制備OGD模型后檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH濃度，發(fā)現(xiàn)隨OGD進(jìn)展LDH漏出進(jìn)行性增高并呈時(shí)間依賴，說明神經(jīng)元損傷破裂顯著。Tunel標(biāo)記法特異地標(biāo)記凋亡細(xì)胞核中暴露的3'-OH末端[11]，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)Tunel、NeuN以及Hoechst 33342染色，計(jì)算凋亡細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)OGD 12h凋亡率最高，可認(rèn)為是本模型最佳凋亡檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。綜上結(jié)果證實(shí)滅菌液體石蠟封閉配合無糖Earle’s液培養(yǎng)制備的OGD模型可以有效誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡。

[1] Iadecola C,Anrather J.Stroke research at a crossroad:asking the brain for directions[J].Nat Neurosci,2011,14(11):1363-1368.

[2] 辛青，程葆華，王琳，等.炎性因子在腦缺血-再灌注不同時(shí)期的基因表達(dá)[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37(4)：240-243.

[3] Tabakman R,Jiang H,Shahar I,et al.Neuroprotection by NGF in the PC12 in vitro OGD model:involvement of mitogen-activated protein kinases and gene expression[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1053:84-96.

[4] Rosenbaum D M,Michaelson M,Batter D K,et al.Evidence for hypoxia-induced,programmed cell death of cultured neurons[J].Ann Neurol,1994,36(6):864-870.

[5] 張擁渡,董為偉.離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谠u(píng)價(jià)神經(jīng)保護(hù)劑中的應(yīng)用[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,1999,16(6):375-377.

[6] Tasca C I,Dal-Cim T,Cimarosti H.In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death[J].Methods Mol Biol,2015,1254:197-210.

[7] Myers K M,Fiskum G,Liu Y,et al.Bcl-2 protects neural cells from cyanide/aglycemia-induced lipid oxidation,mitochondrial injury,and loss of viability[J].J Neurochem,1995,65(6):2432-2440.

[8] Gunasekar P G,Sun P W,Kanthasamy A G,et al.Cyanide-induced neurotoxicity involves nitric oxide and reactive oxygen species generation after N-methyl-D-aspartate receptor activation[J].J Pharmacol Exp Ther,1996,277(1):150-155.

[9] Neuhaus W,Gaiser F,Mahringer A,et al.The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier[J].Front Cell Neurosci,2014,8:352.

[10] 許蜀閩,王培勇,馬洪英.連二亞硫酸鈉在建立培養(yǎng)細(xì)胞的無氧環(huán)境中的應(yīng)用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(4):359-360.

[11] Duranteau J,Chandel N S,Kulisz A,et al.Intracellular signaling by reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes[J].J Biol Chem,1998,273(19):11619-11624.

Induction of apoptosis by oxygen-glucose deprivation of primary cortical neurons in vitro

WUFei，BAIBo，ZHANGQiuling

(Academy of Basic Medicine,Jining Medical University,Jining 272067,China)

ObjectiveTo establish an effective and convenient neuronal apoptosis model in vitro induced by oxygen-glucose deprivation.MethodsThe cortical neurons of newborn rats'was cultured for 7 days.The whole cell culture medium was removed and then Earle's solution with glucose or without glucose was added.The glucose-free Earle's solution was sealed with sterile paraffin liquid.The damage of neurons were observed by MAP-2 fluorescent staining,while the neuronal death and apoptosis were investigated by LDH release and TUNEL staining.ResultsLDH release increased in a time-dependent manner,and the apoptosis could be induced by OGD as showed by TUNEL staining.There was significant difference between OGD and control group.ConclusionIt is feasible to imitate the hypoxia ischemia of neurons in vitro which induces the apoptosis via culturing with glucose-free Earle's solution and sealing with sterile paraffin liquid.

Oxygen-Glucose Deprivation;Apoptosis;Model

* [基金項(xiàng)目]2014年濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：JYQ14KJ19)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.01.004

R338.2

A

1000-9760(2015)02-019-04

2015-01-15)