歐妙玲，陳志華，劉麗雅，朱曉丹

(廣東省佛山市婦幼保健院檢驗(yàn)科 528000)

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·論 著·

Y染色體無(wú)精子癥因子微缺失的篩查與臨床探討

歐妙玲，陳志華，劉麗雅，朱曉丹

(廣東省佛山市婦幼保健院檢驗(yàn)科 528000)

目的 篩查男性不育患者Y染色體無(wú)精子癥因子(AZF)微缺失發(fā)生率，并分析缺失類(lèi)型與臨床表型的關(guān)系。方法 選取2013年1～12月于佛山市婦幼保健院男科就診的男性不育癥患者200例，其中非梗阻性無(wú)精子癥141例，重度少精子癥59例；另選取100例正常孕育男性作為陽(yáng)性對(duì)照；100例正常孕育女性作為陰性對(duì)照。采用聚合酶鏈反應(yīng)分析男性Y染色體AZF微缺失。結(jié)果 特發(fā)性不育組AZF微缺失率顯著高于非特發(fā)性不育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在所有AZF微缺失類(lèi)型中以AZFc最常見(jiàn)，占55.6%；非梗阻性無(wú)精子癥組與重度少精子癥組微缺失率及微缺失類(lèi)型分布情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)微缺失與男性不育具有密切的相關(guān)性。

男性不育癥； Y染色體； 無(wú)精子癥因子

大約有10%～15%育齡夫婦存在不育情況，其中男性因素大約占了50%，在男性不育中30%是因?yàn)檫z傳因素所導(dǎo)致。Tiepolo等于1976年發(fā)現(xiàn)Y染色體長(zhǎng)臂q11區(qū)與精子的生成相關(guān)，稱(chēng)之為無(wú)精子癥因子(AZF)。之后學(xué)者進(jìn)一步研究確定，AZF包含AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域，而AZF的缺失與無(wú)精子或重度少精子的男性原發(fā)性不育具有相關(guān)性[1]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)具有結(jié)果穩(wěn)定、方法簡(jiǎn)便迅速及成本低等優(yōu)點(diǎn)，其在男性不育癥患者外周血DNA篩查Y染色體微缺失區(qū)間等方面逐漸得到推廣應(yīng)用[2]。本研究對(duì)200例不育癥患者Y染色體微缺失進(jìn)行PCR篩查，分析篩查結(jié)果及缺失類(lèi)型與臨床表型的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1～12月于本院男科就診的男性不育癥患者200例，其中非梗阻性無(wú)精子癥患者141例，重度少精子癥患者59例。所有患者均具有正常的男性核型(46，XY)，年齡22～45歲，平均(30.5±5.2)歲。另選擇100例正常孕育男性作為陽(yáng)性對(duì)照；選擇100例正常孕育女性作為陰性對(duì)照，分析微缺失情況。根據(jù)患者是否存在其他睪丸異常、長(zhǎng)期服用棉籽油、腮腺炎病史、精索靜脈曲張、輸精管堵塞等，將200例患者分為特發(fā)性不育組和非特發(fā)性不育組，其中特發(fā)性不育組96例，非特發(fā)性不育組104例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 提取外周血DNA 采用全血細(xì)胞試劑盒進(jìn)行提取，所有操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，提取后于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用多重PCR分析AZFa區(qū)(UsPgY和sY86)、AZFb區(qū)(sYl27和sYl34)、AZFc區(qū)(sY254和sY255)3個(gè)區(qū)6個(gè)位點(diǎn)。內(nèi)對(duì)照為sry基因，陽(yáng)性對(duì)照為正常孕育男性，陰性對(duì)照為正常孕育女性，空白對(duì)照為去離子水。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 30 s，退火 59 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 結(jié)果確認(rèn) 電泳后檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZF缺失的樣本對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行3次獨(dú)立PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，如仍無(wú)目的基因擴(kuò)增條帶，則確定為該位點(diǎn)缺失。

1.3 結(jié)果分析 比較特發(fā)性不育組和非特發(fā)性不育組的缺失率，以及無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的缺失類(lèi)型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 特發(fā)性不育組和非特發(fā)性不育組AZF微缺失率比較 特發(fā)性不育組AZF微缺失率[14.6%(14/96)]顯著高于非特發(fā)性不育組[3.8%(4/104)]，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.777，P<0.05)。

2.2 AZF微缺失類(lèi)型與臨床表型的關(guān)系 見(jiàn)表1。非梗阻性無(wú)精子癥13例患者發(fā)生微缺失，發(fā)生率為9.2%(13/141)，嚴(yán)重少精子癥5例發(fā)生微缺失，發(fā)生率為8.5%(5/59)，兩組微缺失發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在所有AZF微缺失類(lèi)型中以AZFc最常見(jiàn)，占55.6%(10/18)。兩組微缺失類(lèi)型分布情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.714，P>0.05)。

表1 AZF微缺失類(lèi)型與臨床表型的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

全球不孕不育癥的發(fā)生率約為10%～15%，而男性因素大約占到一半。導(dǎo)致男性不育的主要原因包括內(nèi)分泌紊亂、隱睪、精索靜脈曲張、生殖器炎癥、免疫異常等?；蛲蛔兗叭旧w異常所導(dǎo)致的精子生成障礙在男性不育癥發(fā)病中超過(guò)30%,但是文獻(xiàn)報(bào)道的無(wú)精子癥患者染色體核型異常檢出率約為10.5%，主要為47，XXY核型異常。1996年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，精子發(fā)生基因位于Y染色體長(zhǎng)臂的3個(gè)區(qū)域，分別為AZFa、AZFb、AZFc區(qū)域，并提出每個(gè)亞區(qū)均與組織病理學(xué)相關(guān)。1976年研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體長(zhǎng)臂的缺失與精子生成障礙有關(guān)，并推測(cè)在Yq11上存在Y染色體精子生成相關(guān)基因，將此區(qū)域命名為“無(wú)精子癥因子”。既往的研究主要通過(guò)染色體核型分析方法對(duì)Y染色體長(zhǎng)臂的實(shí)際情況進(jìn)行分析。1994年報(bào)道了采用PCR對(duì)不育男性外周血DNA Y染色體微缺失區(qū)間進(jìn)行篩查。由于PCR具有結(jié)果穩(wěn)定、方法簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)多采用PCR進(jìn)行研究[3-4]?；仡檱?guó)內(nèi)外研究結(jié)果顯示，受種族特異性、環(huán)境因素等影響，不同種族、不同地區(qū)、不同病種患者的微缺失發(fā)生率和發(fā)生區(qū)域不相同。

無(wú)精子癥患者因不育而使AZF缺失較少發(fā)生代代相傳，但是隨著現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，這樣的AZF微缺失很可能通過(guò)人為因素而傳給男性后代。通過(guò)對(duì)Y染色體上的DNA序列標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)嚴(yán)重少精子癥和無(wú)精子癥患者進(jìn)行Y染色體上的微缺失進(jìn)行PCR篩查，對(duì)存在微缺失的患者通過(guò)胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，選擇女性胚胎植入，可以避免該微缺失傳給后代，有利于優(yōu)生優(yōu)育。同時(shí)，在分子水平上找到精子生成障礙的病因，可避免不必要的治療，降低經(jīng)濟(jì)損失及治療對(duì)患者造成的痛苦[5]。

既往因Y染色體體積小，含有的基因少，通常認(rèn)為Y染色體的作用就是區(qū)別性別。通過(guò)目前的研究，比較確定AZFc區(qū)的daz基因家族、AZFb區(qū)的rbmyi基因家族、AZFa區(qū)的dby、usp9y基因家族與無(wú)精子癥有關(guān)。關(guān)于AZFc區(qū)的daz基因家族的研究最早，daz為多拷貝基因，編碼的蛋白質(zhì)特異性地在睪丸中表達(dá)，分布于晚期精細(xì)胞和精子的尾部[6]。

本次研究采用PCR檢測(cè)Y染色體的微缺失，選擇AZFa、AZFb、AZFc區(qū)的缺失熱點(diǎn)，瓊脂糖凝膠電泳紫外線燈下觀察片段的大小簡(jiǎn)便易行。在本研究中，伴有AZF微缺失的患者其外周血染色體的核型正常。AZF微缺失可導(dǎo)致精子生成決定基因缺乏，從而造成精子生成障礙。人類(lèi)Y染色體DNA中存在高度的重復(fù)片段，在減數(shù)分裂過(guò)程中95%不進(jìn)行重組，基因的這種不穩(wěn)定性導(dǎo)致基因材料具有較高的自發(fā)丟失率[7]。在分析缺失片段的DNA序中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生缺失的斷裂點(diǎn)多位于順向重復(fù)序列內(nèi)。還有學(xué)者認(rèn)為，Y染色體發(fā)生微缺失的機(jī)制主要是Y染色體在精子發(fā)生過(guò)程中，胚細(xì)胞的快速分裂與卵子發(fā)生過(guò)程相比具有更多的突變機(jī)會(huì)，但又不能像常染色體一樣進(jìn)行DNA修復(fù)，且Y染色體基因?yàn)閱伪扼w，一個(gè)基因缺失就可發(fā)生相應(yīng)的效應(yīng)。也有學(xué)者認(rèn)為，Y染色體微缺失不依賴(lài)于Y染色體出現(xiàn)的背景，是一種隨機(jī)事件。卵細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的發(fā)展為男性不育癥的治療帶來(lái)了福音，但是其缺點(diǎn)是可能將遺傳缺陷遺傳給下一代[8-11]。

近年來(lái)研究結(jié)果顯示，不育男性微缺失的發(fā)生率差異很大，在1%～55%之間。一方面，這可能與研究設(shè)計(jì)是否規(guī)范，陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照是否合適等有關(guān)。本研究對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物存在缺失的患者進(jìn)行了3次重復(fù)的單一引物PCR，從而確保檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。另一方面，所選研究對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)量不同也會(huì)對(duì)發(fā)生率產(chǎn)生影響。男性不育的原因除了遺傳因素外，還存在比如炎癥、精索靜脈曲張、隱睪等其他原因。本研究中200例患者共有18例發(fā)生微因子缺乏，占9.0%，其中無(wú)精子癥患者微因子缺失的發(fā)生率為9.2%，嚴(yán)重少精子癥患者為8.5%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，選取的序列標(biāo)記位點(diǎn)(STS)的標(biāo)記位置、密度不同也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。有學(xué)者認(rèn)為，無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者的Y染色體微缺失發(fā)生率與選擇的STS數(shù)量的多少無(wú)顯著相關(guān)性。也就是說(shuō)，所選擇的STS位點(diǎn)數(shù)量與檢驗(yàn)結(jié)果關(guān)系不大，而主要需選擇已知的、男性不育患者特異缺失的非多態(tài)性位點(diǎn)，同時(shí)位于功能候選基因的DNA序列內(nèi)。本研究對(duì)6個(gè)缺失的熱點(diǎn)位點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示AZFc區(qū)最多，占55.6%。

通過(guò)對(duì)Y染色體微缺失的研究確立Y染色體微缺失基因型與臨床表型的關(guān)系，對(duì)指導(dǎo)臨床實(shí)踐具有重要意義。精子的發(fā)生經(jīng)過(guò)“精原細(xì)胞-初級(jí)精母細(xì)胞-次級(jí)精母細(xì)胞-精子細(xì)胞-精子”的過(guò)程，其發(fā)生過(guò)程中有許多睪丸特異性的基因表達(dá)，從而產(chǎn)生相關(guān)酶類(lèi)或蛋白分子，對(duì)精子的發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。目前，原癌基因和無(wú)精子癥因子基因?qū)影l(fā)生調(diào)控作用的研究較為肯定。Yqll上存在AZFa、AZFb及AZFc精子發(fā)生相關(guān)的位點(diǎn)，它們?cè)谀行陨臣?xì)胞發(fā)育的不同時(shí)期發(fā)揮作用。AZFa區(qū)缺失導(dǎo)致精子阻滯發(fā)生在青春期前階段，主要表現(xiàn)為唯塞爾托利細(xì)胞綜合征(SCOS)和小睪丸。AZFb區(qū)缺失導(dǎo)致精子阻滯發(fā)生在青春期減數(shù)分裂前、后或者減數(shù)分裂期間，初級(jí)精母細(xì)胞階段。AZFc區(qū)缺失可表現(xiàn)為SCOS、單個(gè)精母細(xì)胞、單個(gè)成熟精子及少精子癥等。AZFc區(qū)缺失的患者，對(duì)睪丸進(jìn)行多點(diǎn)活檢，有可能發(fā)現(xiàn)隱含的具有正常精子的生精小島，進(jìn)行冷凍可行睪丸精子吸取術(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)，AZFc缺失的少精子癥患者，部分可發(fā)展為無(wú)精子癥，因此，對(duì)這類(lèi)患者應(yīng)盡早給予治療，或者將精液冷凍保存。

特發(fā)性不育也稱(chēng)原因不明性不育，指應(yīng)用現(xiàn)有的診斷手段不能找出不育病因的一種類(lèi)型，多與遺傳缺陷、基因突變、染色體異常等導(dǎo)致精子發(fā)生障礙有關(guān)。本研究中特發(fā)性不育患者的AZF微缺失率顯著高于非特發(fā)性不育患者，由此證實(shí)遺傳缺陷是特發(fā)性不育的主要病因之一。但是，也有3.8%的非特發(fā)性不育患者存在AZF微缺失，說(shuō)明此類(lèi)患者也存在AZF微缺失的情況。

綜上所述，Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區(qū)微缺失與男性不育有密切的相關(guān)性。本研究共納入6個(gè)基因位點(diǎn)，表明AZF區(qū)域與不育癥患者無(wú)精子之間存在相關(guān)性。但因樣本量及所選基因位點(diǎn)數(shù)量的局限，需要增加樣本量及研究位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Screening and clinical phenotype explore of Y chromosome microdeletions of azoospermia factor in male infertility patients

OUMiao-ling，CHENZhi-hua，LIULi-ya，ZHUXiao-dan

(DepartmentofClinicalLaboratory，MaternalandChildrenHealthHospitalofFoshanCity,Foshan,Guangdong528000,China)

Objective To investigate incidence of Y chromosome microdeletions of azoospermia factor (AZF) in male infertility patients,and to analyze the relationship between types of gene deletion and clinical phenotype.Methods A total of 200 cases of patients with male infertility were recruited in this study from January to December 2013,including 141 cases with non-obstructive azoospermia and 59 cases with severe oligozoospermia.Another 100 healthy males were enrolled as positive control group,and 100 healthy females were enrolled as negative control group.Male Y chromosome AZF microdeletions were analyzed by using polymerase chain reaction method.Results The incidence of AZF microdeletions of idiopathic infertility group was significantly higher than that of non-idiopathic infertility group (P<0.05).In all types of AZF microdeletions,AZFc was the most common type,accounting for 55.6%.No significant differences of AZF microdeletions incidence and distribution of types of AZF microdeletions were found between non-obstructive azoospermia group and severe oligozoospermia group (P>0.05).Conclusion Y chromosome AZFa,AZFb and AZFc microdeletion could be closely correlated to male infertility.

male infertility; Y chromosome; azoospermia factor

歐妙玲，女，本科，主管技師，主要從事細(xì)胞遺傳方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.031

A

1672-9455(2015)03-0365-03

2014-08-15

2014-10-05)