趙 丹，楊小猛，陳倩瑜，歐彩蘭，林凌云

(1.廣東省深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院 518023；2.廣東省深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院 518019；3.廣東省深圳市第一勞動(dòng)教養(yǎng)管理所 518020)

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·論 著·

熒光定量PCR檢測(cè)梅毒螺旋體方法的建立及初步應(yīng)用*

趙 丹1，楊小猛2，陳倩瑜1，歐彩蘭1，林凌云3

(1.廣東省深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院 518023；2.廣東省深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院 518019；3.廣東省深圳市第一勞動(dòng)教養(yǎng)管理所 518020)

目的 采用二聚體蝎型探針技術(shù)建立一種高敏感性和特異性的檢測(cè)梅毒螺旋體(TP)的熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法。方法 根據(jù)TP特異性外膜蛋白Gpd的基因序列設(shè)計(jì)引物和熒光探針，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建可用于TP定量的標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化熒光定量PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立檢測(cè)TP的二聚體蝎型探針定量PCR。采用本研究建立方法和商品化熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)40例臨床標(biāo)本，對(duì)比分析檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果 成功構(gòu)建了TP重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和TP的二聚體蝎型探針定量PCR，該方法線性范圍為101～108copy/mL，靈敏度為10 copy/mL，特異性和敏感性均為100.0%；二聚體蝎型探針定量PCR對(duì)疑似梅毒病例陽性檢出率顯著高于目前商品化Taqman熒光定量PCR試劑盒(82.5%vs62.5%，P<0.05)。結(jié)論 成功建立了二聚體蝎型探針熒光定量PCR快速檢測(cè)TP的方法，為臨床上TP的早期診斷和防控奠定了基礎(chǔ)。

二聚體蝎型探針； 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)； 梅毒螺旋體

梅毒是由梅毒螺旋體(TP)引起的，嚴(yán)重危害人類健康的性傳播疾病之一，近年來我國梅毒發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。梅毒不僅可以在普通人群中水平傳播，還可以通過母胎垂直傳播，引起先天性梅毒。早診斷、早治療對(duì)控制梅毒蔓延至關(guān)重要[2]。目前國內(nèi)外TP的檢測(cè)方法主要有病原體檢測(cè)法和血清學(xué)試驗(yàn)：病原體檢測(cè)法是目前最特異、最準(zhǔn)確的診斷方法，但靈敏度低；非TP抗原血清學(xué)試驗(yàn)敏感性高而特異性較低；TP抗原血清學(xué)試驗(yàn)敏感性和特異性都很高，但不能反映梅毒治療效果及治愈情況，也不能判斷其是否具有傳染性。分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，將可能提高TP的診斷效率[3]。二聚體蝎型探針定量技術(shù)是目前發(fā)展迅速的分子生物學(xué)診斷技術(shù)之一，與現(xiàn)有的基于Taqman熒光探針技術(shù)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)比較，該技術(shù)具有敏感度更高、成本更低等特點(diǎn)[4]。目前國內(nèi)外少見二聚體蝎型探針定量技術(shù)用于TP的報(bào)道，本研究擬采用該技術(shù)建立新型的TP熒光定量PCR。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來源 按《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 273-2007)》收集的40例疑似病例和22例確診病例患者血清標(biāo)本均來自深圳市羅湖區(qū)第一勞動(dòng)教養(yǎng)管理所在押勞教人員；8份TP陰性血清標(biāo)本來自健康體檢者。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α由本課題組保存，原核表達(dá)載體pET28a購于美國GE公司。

1.1.3 試劑與儀器 熱啟動(dòng)Taq酶、UNG酶、dNTPs、緩沖液、MgCl2、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及HindⅢ和pMD18-T載體連接系統(tǒng)購自大連寶生物公司；瓊脂糖、EB和膠回收試劑盒購自北京博凌科為公司；Marker購自美國MBI公司；梅毒Taqman熒光定量PCR試劑盒購自廣州中山達(dá)安公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自南京森貝伽公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國Qiagen公司。ABI-7500熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì)合成 以TP特異性外膜蛋白Gpd基因序列為模板，擴(kuò)增序列長164 bp。采用Primer-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)特異性探針和引物，并由上海生工生物公司合成和標(biāo)記。普通PCR上游引物F1:5′-GCC AGC GCT TTC CTC TTT G-3′，下游引物R1:5′-CGC TGC GAT GTC TTT TCC TT-3′。二聚體蝎型探針上游引物和標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)的核苷酸鏈由線性多聚體(HEG)連接為F2:5′-FAM-TGG TTT TAG GCT GCA CAC TTT HEG GCC AGC GCT TTC CTC TTT G-3′，標(biāo)記猝滅基團(tuán)的互補(bǔ)鏈為5′-AAA GTG TGC AGC CTA AAA CCA DAB CYL-3′，下游引物R2:5′-CGC TGC GAT GTC TTT TCC TT-3′。

1.2.2 標(biāo)本處理 取疑似病例和確診病例患者及健康體檢者血清100 μL，加入等量DNA濃縮試劑，振蕩混勻，10 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入20 μL DNA提取液，振蕩混勻并瞬時(shí)離心，置100 ℃干熱孵育器中10 min，立即放入4 ℃離心機(jī)，10 000 r/min離心10 min，留取上清液標(biāo)本備用。取確診病例患者血清DNA標(biāo)本用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pET28a-Gpd的構(gòu)建 反應(yīng)體系總體積為30 μL：梅毒螺旋體DNA模板2 μL、普通PCR上、下游引物各3 μL、緩沖液3 μL、MgCl22 μL、dNTP 3 μL、Taq酶0.5 μL、無DNA酶去離子水16.5 μL。循環(huán)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳初步鑒定，采用膠回收試劑盒回收目的DNA，定量后克隆到T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，用異丙基硫代半乳糖苷/5-溴-4氯-3-吲哚-β半乳糖苷/氨芐青霉素平板篩選出陽性克隆，含Amp 60 μg/mL的LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切和PCR鑒定。

1.2.4 二聚體蝎型探針定量PCR體系和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化 本研究擬擴(kuò)增模板為164 bp，結(jié)合二聚體蝎型探針的特性，選用變性和退火二步循環(huán)法。參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道，二聚體蝎型探針可采用PCR快循環(huán)，其循環(huán)參數(shù)設(shè)置應(yīng)滿足PCR反應(yīng)時(shí)間最短但不影響熒光曲線的要求。為節(jié)約試劑成本，本研究反應(yīng)體系總體積為20 μL，DNA模板2 μL，設(shè)置鎂離子濃度梯度、探針濃度梯度、報(bào)告探針和淬滅探針濃度比梯度，并優(yōu)化組合。通過分析PCR產(chǎn)物的電泳條帶，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熒光曲線的背景、熒光值的峰值、信噪比和擴(kuò)增曲線的形態(tài)來評(píng)價(jià)反應(yīng)體系，從而最終建立最佳的熒光定量PCR反應(yīng)體系。

1.2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià) (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍。采用含Amp的LB肉湯增菌培養(yǎng)陽性克隆大腸桿菌，收集細(xì)菌并抽提質(zhì)粒，定量后進(jìn)行10倍梯度稀釋得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品:101～108copy/mL，以該序列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，ABI-7500 PCR儀自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性，以保持相關(guān)系數(shù)大于或等于 0.99的稀釋濃度確定本方法的線性范圍。(2)靈敏度。采用雙蒸水將質(zhì)粒按10倍梯度稀釋至10 copy/mL，用雙蒸水做無模板對(duì)照，進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，以能區(qū)別于無模板對(duì)照的最低質(zhì)粒濃度即為本方法的靈敏度。(3)特異性和敏感性。采用建立的方法檢測(cè)22例確診病例患者和8例TP陰性血清標(biāo)本，計(jì)算本方法的特異性、敏感性、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和總有效率。(4)方法學(xué)比較。以Taqman定量PCR為比對(duì)方法，與二聚體蝎型探針方法同時(shí)檢測(cè)40份疑似梅毒患者血清標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，二聚體蝎型探針定量PCR和Taqman定量PCR檢測(cè)結(jié)果比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，其理論酶切產(chǎn)物為164 bp，產(chǎn)物電泳后條帶位置與理論值相符。以質(zhì)粒為模板，采用構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的引物按原反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳后條帶位置與理論值亦相符(圖1)。

注：M為Marker；1為陰性對(duì)照；2為雙酶切；3為PCR擴(kuò)增。

圖1 重組質(zhì)粒鑒定的電泳圖

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù) 經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)，本研究最佳熒光反應(yīng)體系如下：總體積20 μL、模板2 μL、上游引物和報(bào)告探針F2(5 μmol/L)2 μL、下游引物R2(5 μmol/L)2 μL、淬滅探針(25 μmol/L)2 μL、緩沖液(10×)2 μL、dNTP (2.5 mmol/L)2 μL、MgCl2(25 mmol/L)2 μL、Taq酶(5 U/μL)0.2 μL、UNG酶0.1 μL、無DNA酶H2O 5.7 μL。最佳循環(huán)參數(shù)：93 ℃ 2 min預(yù)變性；93 ℃ 45 s →55 ℃ 30 s并采集熒光信號(hào)；共40個(gè)循環(huán)。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià) (1)線性范圍：二聚體蝎型探針方法在101～108copy/mL質(zhì)粒濃度范圍內(nèi)線性良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-2.45X+12.67，r=0.992 3。(2)靈敏度：二聚體蝎型探針方法能區(qū)別于無模板對(duì)照的最低模板濃度(靈敏度)為10 copy/mL。(3)特異性和敏感性：二聚體蝎型探針方法檢測(cè)22例確診病例均為陽性，檢測(cè)8例健康體檢者均為陰性，其敏感性、特異性、陽性預(yù)示值、陰性預(yù)示值和總有效率均為100.0%。

2.4 二聚體蝎型探針方法與Taqman熒光定量PCR結(jié)果的比較 以Taqman定量方法和二聚體蝎型探針方法同時(shí)檢測(cè)40例疑似梅毒患者血清標(biāo)本，其中25例標(biāo)本兩種方法均為陽性，8例標(biāo)本Taqman熒光定量PCR檢測(cè)為陰性，而蝎型探針方法定量結(jié)果分別為:1.28×102、0.53×102、1.21×101、1.51×102、1.18×101、1.26×102、7.82×101、1.33×102copy/mL，7例標(biāo)本兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性。二聚體蝎型探針方法陽性檢出率為82.5%，Taqman定量方法陽性檢出率為62.5%，前者顯著高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩種定量PCR檢測(cè)40例疑似病例血清的結(jié)果(n)

3 討 論

梅毒是由TP引起的，嚴(yán)重危害人類健康的性傳播疾病之一，主要通過性接觸和血液傳播。梅毒是一種傳染性強(qiáng)且危害性大的疾病，不僅可以在普通人群中水平傳播，還可以經(jīng)母胎垂直傳播，引起先天性梅毒[2,6]。因此，早診斷、早治療對(duì)控制梅毒蔓延至關(guān)重要，而選擇敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法將有助于梅毒(特別是早期梅毒)診斷。

國內(nèi)外目前檢測(cè)TP主要有以下幾種方法：(1)病原體檢測(cè)，包括暗視野顯微鏡檢查、銀染色法、熒光抗體染色法等直接檢測(cè)TP的方法。(2)血清學(xué)試驗(yàn)，包括性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)、快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)、不加熱血清反應(yīng)素試驗(yàn)和甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)等非特異性血清學(xué)試驗(yàn)，以及梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)、梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)、TP-ELISA和免疫印跡等特異性血清學(xué)試驗(yàn)。(3)基因診斷技術(shù)。這些試驗(yàn)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)：病原體檢測(cè)法直接觀察分泌物中的TP，可直接診斷梅毒，是目前最特異、最準(zhǔn)確的診斷方法，但靈敏度低[7]。非特異性血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)反應(yīng)素等非特異性抗體，敏感性高而特異性較低。特異性血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)TP抗體，敏感性和特異性都很高，可作為確認(rèn)試驗(yàn)，但不能反映梅毒治療效果及治愈情況，也不能判斷是否具有傳染性，僅適合于大批量的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[8]?；蛟\斷技術(shù)檢測(cè)TP DNA，有很強(qiáng)的特異性和很高的敏感性，但目前國內(nèi)PCR試劑盒質(zhì)量有待改進(jìn)，同時(shí)試劑成本較高[4,9]。

PCR可以在TP抗體產(chǎn)生前幾周檢測(cè)出TP DNA，即窗口期隱性感染；實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、絕對(duì)定量和高通量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，克服了傳統(tǒng)TP檢測(cè)技術(shù)敏感性低、定量困難、假陽性率高等缺點(diǎn)[4]。常用的Taqman探針技術(shù)存在探針標(biāo)記和純化難度高、Taq酶要求高且反應(yīng)時(shí)間較長等不足之處。Solinas等[10]使用二聚體蝎型探針進(jìn)行SNP分析，這種探針通過一個(gè)HEG連接在引物5′端，探針可與該引物擴(kuò)增后的新生鏈互補(bǔ)，熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在探針5′端；另有一條單獨(dú)的猝滅鏈與探針互補(bǔ)，猝滅基團(tuán)標(biāo)記在猝滅鏈3′端。無特異性產(chǎn)物時(shí)，猝滅鏈和探針雜交，從而無熒光產(chǎn)生；有特異性產(chǎn)物時(shí)，由于分子內(nèi)部雜交比分子間雜交更容易，探針更易雜交到產(chǎn)物鏈上并產(chǎn)生特異熒光。

本研究首次建立了二聚體蝎型探針熒光定量PCR檢測(cè)TP的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了初步的方法學(xué)評(píng)價(jià)，其線性范圍為101～108copy/mL，靈敏度為10 copy/mL，特異性和敏感性均為100.0%。二聚體蝎型探針方法對(duì)疑似梅毒患者陽性檢出率顯著高于常用的Taqman熒光定量PCR。后續(xù)試劑盒研發(fā)的優(yōu)化試驗(yàn)中作者進(jìn)一步將對(duì)該方法的批內(nèi)、批間重復(fù)性，反應(yīng)體系穩(wěn)定性，以及病原體檢測(cè)特異性等參數(shù)進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。二聚體蝎型探針定量PCR為臨床上早期診斷TP和控制其蔓延奠定了試驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，可在今后TP的監(jiān)測(cè)等方面開展應(yīng)用。

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Establishment and clinical application of fluorescent quantitation PCR for rapid detection of treponema pallidum*

ZHAODan1,YANGXiao-meng2,CHENQian-yu1,OUCai-lan1,LINLing-yun3

(1.LuohuChronicDiseasePreventionandCureHospital,Shenzhen,Guangdong518023,China;2.LuohuMaternityandChildCareHospital,Shenzhen,Guangdong518019,China;3.ShenzhenFirstReeducationUnit,Shenzhen,Guangdong518020,China)

Objective To establish a sensitive and specific fluorescent quantitation PCR (FQ-PCR) by using duplex scorpion primer for rapid detection of treponema pallidum (TP).Methods Primer and fluorescent probe were designed based on the gene order of TP outer membrane protein Gpd.Quantitative standard preparation of TP was constructed by using gene recombination.Duplex scorpion primer FQ-PCR for rapid detection of TP was established by optimizing the reaction system and reaction condition.Totally 40 suspected cases were detected by our FQ-PCR and commercial FQ-PCR respectively and the difference was analyzed.Results Duplex scorpion primer FQ-PCR for rapid detection of TP was established successfully.The linear range of the method was 101-108copy/mL and the sensitivity was 10 copy/mL,susceptibility and specificity were 100.0%.The positive detection rate of the suspected cases by our method was sharply higher than that by commercial FQ-PCR kit (82.5%vs62.5%，P<0.05).Conclusion Duplex scorpion primer FQ-PCR for rapid detection of TP was established successfully,which could be used for early diagnosis and preventive control of TP.

duplex scorpion primer; fluorescent quantitation PCR; treponema pallidum

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(201203196)。

趙丹，女，博士，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.015

A

1672-9455(2015)03-0324-03

2014-08-19

2014-10-05)