趙 毅，王 燕，胡新榮

(廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808)

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·論 著·

慢病毒感染穩(wěn)定敲減eIF4E基因的鼻咽癌CNE2細(xì)胞系的建立*

趙 毅，王 燕，胡新榮△

(廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808)

目的 構(gòu)建穩(wěn)定干擾真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2細(xì)胞系。方法 設(shè)計針對eIF4E基因mRNA序列的RNA干擾序列，以慢病毒載體pGC-LV為基礎(chǔ)構(gòu)建感染體系。慢病毒感染CNE2細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素壓力篩選穩(wěn)定敲減eIF4E基因的CNE2細(xì)胞株。采用定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡法檢測eIF4E mRNA和蛋白的表達(dá)水平；采用細(xì)胞增殖和遷徙實(shí)驗驗證eIF4E敲減對CNE2細(xì)胞的影響。結(jié)果 成功構(gòu)建并篩選獲得帶有eIF4E特異性短發(fā)夾RNA的慢病毒顆粒；將慢病毒顆粒轉(zhuǎn)入CNE2細(xì)胞，經(jīng)抗菌藥物壓力篩選獲得穩(wěn)定敲減eIF4E基因的CNE2細(xì)胞(CNE2siEp)及陰性對照細(xì)胞(CNE2siNC)。與CNE2siNC細(xì)胞相比，CNE2siEp細(xì)胞eIF4E mRNA表達(dá)水平下調(diào)76.0%，蛋白表達(dá)水平下調(diào)50.0%，細(xì)胞增殖活性下調(diào)85.0%，運(yùn)動活性下調(diào)59.0%。結(jié)論 成功構(gòu)建穩(wěn)定敲減eIF4E的CNE2細(xì)胞系，其eIF4E基因表達(dá)水平與功能明顯受抑。

真核起始因子4E; 敲減; 慢病毒感染; RNA干擾

真核起始因子4E(eIF4E)是真核生物細(xì)胞蛋白質(zhì)合成步驟中生成翻譯起始復(fù)合物的必需因子之一[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，eIF4E在肺癌、乳腺癌、食管癌等多種腫瘤組織中表達(dá)水平升高，并與腫瘤轉(zhuǎn)移、治療后復(fù)發(fā)等存在一定的關(guān)系[2-3]。有研究顯示，eIF4E過表達(dá)與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)，但其作用機(jī)制尚未完全明確[4-5]。為研究eIF4E在鼻咽癌增殖、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，探尋調(diào)控鼻咽癌早期轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)，需要構(gòu)建穩(wěn)定干擾基因表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞系。慢病毒感染體系是目前常用的能夠較為穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染基因克隆的病毒體系之一[6]。慢病毒感染體系感染分裂細(xì)胞或非分裂細(xì)胞后，可以在細(xì)胞內(nèi)長期表達(dá)且安全性較高[7]；結(jié)合抗菌藥物壓力篩選方法，則可用于構(gòu)建穩(wěn)定基因過表達(dá)與敲減細(xì)胞系[8]。構(gòu)建穩(wěn)定敲減eIF4E基因的鼻咽癌細(xì)胞系有助于更好地探尋eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中的作用，分析其參與調(diào)控鼻咽癌轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。因此，本研究以針對eIF4E基因mRNA的小干擾RNA(siRNA)序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了慢病毒感染體系，在對低分化鼻咽癌細(xì)胞系CNE2細(xì)胞進(jìn)行感染后分析了eIF4E敲減對鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷徙活性的影響?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 慢病毒包裝質(zhì)粒pGC-LV、pHelper1.0、pHelper2.0及靶向eIF4E的siRNA片段由上海吉凱基因技術(shù)有限公司設(shè)計、合成。限制性核酸內(nèi)切酶及T4連接酶購自美國NEB公司。大腸埃希菌DH5α株及質(zhì)粒提取試劑盒購自德國Qiagen公司。人胚腎細(xì)胞293T及人肺腺癌細(xì)胞H1299購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。CNE2細(xì)胞由本實(shí)驗室保存。trizol試劑和莫洛尼鼠白血病病毒第一鏈合成試劑購自美國Life Technology公司，轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測試劑FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)購自德國Roche公司。放射免疫沉淀裂解緩沖液系統(tǒng)(RIPA Lysis Buffer System)、鼠抗人eIF4E單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruz公司。細(xì)胞增殖活性檢測CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Transwell小室(8 μm)購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎細(xì)胞293T、人肺腺癌細(xì)胞H1299、鼻咽癌低分化細(xì)胞CNE2均采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清及雙抗)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。所有細(xì)胞學(xué)實(shí)驗均在細(xì)胞傳代12代以內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾質(zhì)粒的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[9]及前期實(shí)驗結(jié)果，針對eIF4E基因3個轉(zhuǎn)錄本(NM_001968.3、NM_001130679.1、NM_001130678.1)的同源序列設(shè)計靶點(diǎn)，共設(shè)計4個RNA干擾靶點(diǎn)序列，包括KD1：5′-AAG GAT GGT ATT GAG CCT ATG-3′；KD2：5′-GAG GAC GAT GGC TAA TTA CAT-3′；KD3：5′-CGG CTG ATC TCC AAG TTT GAT-3′；KD4：5′-CCA CTC TGT AAT AGT TCA GTA-3′?；瘜W(xué)合成序列，退火、冷卻后與經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ處理的pGCL-GFP載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)后挑選單克隆菌落，經(jīng)PCR鑒定并測序明確插入序列的方向及完整性，即為干擾質(zhì)粒pGCLV-eIF4E-shRNA(編號#1～4)。

1.2.3 慢病毒包裝 將病毒包裝細(xì)胞293T以濃度6×105個/毫升接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟參照試劑說明書。轉(zhuǎn)染8 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基；常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清，用0.45 μm濾器去除細(xì)胞碎片，離心濃縮用于病毒感染。

1.2.4 慢病毒感染及最佳靶點(diǎn)篩選 選取對數(shù)生長期H1299細(xì)胞，以濃度5×104個/孔接種六孔板，設(shè)置空白對照組、陰性對照組和4個帶有干擾序列的病毒干預(yù)組(KD1～4)，每組包括3個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約30%。向病毒干預(yù)組和陰性對照組中加入制備好的4組eIF4E-RNAi-LV病毒及陰性對照病毒，空白對照組不加入病毒。感染12 h后更換培養(yǎng)基，感染5 d后提取各組細(xì)胞RNA，采用定量PCR檢測eIF4E基因表達(dá)相對水平，篩選最佳干擾靶點(diǎn)。

1.2.5 抗菌藥物篩選與感染細(xì)胞培養(yǎng) 以感染H1299細(xì)胞的方法感染CNE2細(xì)胞，病毒干預(yù)組采用經(jīng)干擾靶點(diǎn)篩選后確定的eIF4E-RNAi-LV-#2病毒，陰性對照組采用陰性對照病毒。感染5 d后更換培養(yǎng)基(含濃度為1.0 μg/mL的嘌呤霉素)，持續(xù)觀察細(xì)胞，每3天更換1次培養(yǎng)基(含新鮮嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)基)，7 d后擴(kuò)大培養(yǎng)，直至感染后29 d；挑取單克隆細(xì)胞，移至新培養(yǎng)皿中擴(kuò)大培養(yǎng)。eIF4E穩(wěn)定干擾細(xì)胞株命名為CNE2siEp細(xì)胞，陰性對照病毒感染細(xì)胞命名為CNE2siNC細(xì)胞。

1.2.6 eIF4E表達(dá)水平檢測 采用定量PCR方法檢測細(xì)胞eIF4E mRNA表達(dá)水平，采用免疫印跡法(Western Blot)檢測eIF4E蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 細(xì)胞生長周期、增殖活性及遷徙活性檢測 采用CCK8試劑盒檢測CNE2siEp、CNE2siNC、CNE2細(xì)胞生長水平及增殖活性，采用細(xì)胞運(yùn)動實(shí)驗檢測細(xì)胞遷徙活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 eIF4E-RNAi-LV慢病毒顆粒最佳干擾靶點(diǎn)篩選 采用4個帶有干擾序列的病毒對H1299細(xì)胞進(jìn)行感染，其中KD2(eIF4E-RNAi-LV-#2)、KD3(eIF4E-RNAi-LV-#3)對目的基因eIF4E表達(dá)的干擾作用較陰性對照組升高超過85.0%，其中KD2為最有效靶點(diǎn)。因此，采用eIF4E-RNAi-LV-#2病毒進(jìn)行驗證實(shí)驗。在以CNE2細(xì)胞作為靶細(xì)胞的病毒感染干擾實(shí)驗中，KD2組(eIF4E-RNAi-LV-#2病毒干擾)對目的基因eIF4E表達(dá)的干擾作用較陰性對照組升高超過70.0%。因此，以eIF4E-RNAi-LV-#2病毒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗，并將病毒命名為eIF4E-RNAi-LV病毒。

2.2 eIF4E-RNAi-LV病毒感染CNE2細(xì)胞對eIF4E表達(dá)的影響 CNE2siNC細(xì)胞、CNE2細(xì)胞eIF4E mRNA相對表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CNE2siEp細(xì)胞eIF4E mRNA表達(dá)水平較CNE2siNC降低76.0%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。CNE2細(xì)胞、CNE2siNC細(xì)胞eIF4E蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CNE2siEp細(xì)胞eIF4E蛋白表達(dá)水平較CNE2siNC細(xì)胞降低50.0%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1B、C。CNE2siEp細(xì)胞eIF4E基因的表達(dá)被明顯沉默，可用于后續(xù)實(shí)驗。

注：A為各組間eIF4E mRNA相對表達(dá)水平比較；B為各研究組eIF4E蛋白Western Blot檢測結(jié)果；C為各組間eIF4E蛋白相對表達(dá)水平比較；**表示組間比較P<0.05。

圖1 各研究組細(xì)胞eIF4E mRNA及蛋白相對表達(dá)水平比較

2.3 eIF4E敲減對CNE2細(xì)胞生長周期和增殖活性的影響 CNE2細(xì)胞、CNE2siNC細(xì)胞生長速度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與CNE2siNC細(xì)胞比較，CNE2siEp細(xì)胞生長速度在培養(yǎng)前5 d明顯被抑制，細(xì)胞生長速度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。病毒感染48 h后，CNE2細(xì)胞、CNE2siNC細(xì)胞增殖活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與CNE2siNC細(xì)胞比較，CNE2siEp細(xì)胞增殖活性降低85.0%，細(xì)胞增殖活性組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2B。

2.3 eIF4E敲減對CNE2細(xì)胞遷徙活性的影響 各研究組細(xì)胞運(yùn)動實(shí)驗染色檢測結(jié)果見圖3。CNE2細(xì)胞、CNE2siNC細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與CNE2siNC細(xì)胞比較，CNE2siEp細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)降低59.0%，穿膜細(xì)胞數(shù)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為各研究組細(xì)胞生長曲線；B為各研究組細(xì)胞感染48 h后增殖活性比較；**表示組間比較P<0.05。

圖2 eIF4E敲減對CNE2細(xì)胞生長周期和增殖活性的影響

圖3 各研究組細(xì)胞運(yùn)動實(shí)驗染色檢測結(jié)果

3 討 論

RNA干擾是機(jī)體抵御外來基因和病毒感染的基因調(diào)控方式之一，可通過雙鏈RNA降解同源mRNA，進(jìn)而在RNA水平抑制基因的表達(dá)。RNA干擾具有特異性和高效性的特點(diǎn)，可在核酸水平調(diào)控細(xì)胞基因的表達(dá)[10]。本研究所使用的pGC-LV慢病毒系統(tǒng)以“自殺性改造”為基礎(chǔ)，采用三質(zhì)粒包裝構(gòu)建獲得，安全性高、操作簡單、感染效率較高，而且能夠在體外合成構(gòu)建siRNA的表達(dá)載體shRNA，進(jìn)而在專用工程細(xì)胞293T中結(jié)合輔助質(zhì)粒，表達(dá)并包被。經(jīng)熒光篩選獲得可產(chǎn)生shRNA的高滴度慢病毒顆粒，再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄加工，即可生成siRNA。本研究采用eIF4E-RNAi-LV轉(zhuǎn)染H1299、CNE2細(xì)胞，證實(shí)了可高效敲減eIF4E表達(dá)的siRNA靶點(diǎn)序列。此外，本研究結(jié)合抗菌藥物壓力篩選，成功在相對較短的時間內(nèi)獲得了高純度的穩(wěn)定敲減eIF4E的CNE2siEp細(xì)胞及其對照細(xì)胞CNE2siNC，為進(jìn)一步研究相關(guān)基因功能和細(xì)胞生物學(xué)行為奠定了基礎(chǔ)。

eIF4E可選擇性翻譯癌基因mRNA，并參與癌蛋白的表達(dá)，對細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移均可能存在影響[1]。然而，eIF4E在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平和功能，特別是其參與癌基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制尚未完全明確。筆者在前期實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)eIF4E蛋白與鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與了腫瘤上皮介質(zhì)轉(zhuǎn)化和復(fù)發(fā)。因此，本研究構(gòu)建了eIF4E穩(wěn)定敲減的鼻咽癌低分化細(xì)胞系CNE2siEp細(xì)胞及其對照細(xì)胞。初步細(xì)胞生物學(xué)行為檢測發(fā)現(xiàn)，eIF4E穩(wěn)定敲減的CNE2siEp細(xì)胞與未經(jīng)感染處理的CNE2細(xì)胞、陰性對照CNE2siNC細(xì)胞相比，增殖活性下降，生長周期異常，遷徙活性明顯降低，提示CNE2細(xì)胞內(nèi)的eIF4E敲減明顯影響了細(xì)胞的生物學(xué)行為，也說明eIF4E基因在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，為進(jìn)一步研究其在基因表達(dá)調(diào)控中的作用和分子機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Construction of stable eIF4E knockdown nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line by lentivirus infection*

ZHAOYi,WANGYan,HUXin-rong△

(BasicMedicalSchool,GuangdongMedicalCollege,Dongguan,Guangdong523808,China)

Objective To establish a nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line with stable interference of eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) gene.Methods The interference sequences,targeting eIF4E gene sequence,were designed,coated and transfected into CNE2 cells,by using lentiviral vector infection system based on pGC-LV.The cells containing stable transformants were screened by the ability of resistance to puromycin.The expression of eIF4E was assayed by real-time polymerase chain reaction and Western Blot.The effects of eIF4E knockdown on proliferation and migration of CNE2 cells were tested.Results The lentivirus particles with short hairpin shRNA targeting eIF4E gene were constructed and screened successfully.CNE2 cells were transfected and anti-pure positive cell,which was named CNE2siEp cell,were obtained by antibiotic screening.Compared with negative control cells (CNE2siNC),the expression of eIF4E mRNA and protein in CNE2siEp cells were significantly decreased by 76.0% and 50.0% respectively.The proliferation and migration of CNE2siEp cells were also decreased by 85.0% and 59.0% respectively.Conclusion The stable eIF4E knockdown cell line (CNE2siEp) was constructed successfully,in which the expression and functions of eIF4E gene were inhibited significantly.

eukaryotic initiation factor 4E; knockdown; lentivirus infection; RNA interference

廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金項目(B2013291)。

趙毅，男，講師，博士研究生，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究?！?/p>

，E-mail：chz020@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.07.005

A

1672-9455(2015)07-0888-03

2014-11-22

2014-12-28)