楊閏平，李安信，李曉鵬，劉元林

生殖器皰疹一般由單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）－2（少數(shù)為 HSV－1）感染生殖器皮膚黏膜而導(dǎo)致簇集性水皰性的性傳播疾病，病情不活動(dòng)時(shí)HSV可潛伏在局部神經(jīng)節(jié)中。生殖器皰疹難以根治，容易復(fù)發(fā)。一般認(rèn)為復(fù)發(fā)頻率與患者的免疫功能狀態(tài)有關(guān)，一年內(nèi)復(fù)發(fā)超過6次為頻繁復(fù)發(fā)。

漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells,pDCs）主要功能和特征是在病毒或病毒來源的核酸刺激下分泌Ⅰ型干擾素（interferon,IFN）（IFNα/β），參與機(jī)體免疫反應(yīng)以及橋接機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫[1]。近年來發(fā)現(xiàn)pDCs在生殖器皰疹皮損中有浸潤，且HSV暴露后的pDCs在體外可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，認(rèn)為pDCs參與了生殖器皰疹的抗病毒免疫反應(yīng)[2]。但有研究發(fā)現(xiàn)pDCs僅對系統(tǒng)感染的HSV有免疫反應(yīng)，對局部感染的HSV無免疫反應(yīng)，即pDCs對HSV的不同感染途徑有選擇性的免疫作用[3]。本文主要研究pDCs在復(fù)發(fā)性生殖器皰疹中的免疫作用，探索其在預(yù)防生殖器皰疹復(fù)發(fā)中的可能角色。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院門診確診的10例生殖器皰疹患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞18歲男性；②病程1年以上；③復(fù)發(fā)頻率≥6次/年；④診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《梅毒、淋病、生殖器皰疹、生殖道沙眼衣原體感染診療指南（2014）》[4]。剔除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤患者、嚴(yán)重心腦血管病及結(jié)締組織病等系統(tǒng)疾病患者；②有酗酒習(xí)慣，抽煙＞20支/d。獲取知情同意后于靜息期（2次疾病發(fā)作間期）、發(fā)病早期（病程第1 d）和發(fā)病后期（病程第6 d）分別空腹抽取患者靜脈血6ml，3ml置于肝素抗凝管進(jìn)行白細(xì)胞分離備用，3ml置于促凝管進(jìn)行血清分離備用。選10名健康成年男性為對照組，其靜脈血處理同前。

1.2 外周血白細(xì)胞的分離 采用P8670人外周血白細(xì)胞分離液solarbio試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）分離白細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行操作。方法如下：將1 ml新鮮抗凝血用組織稀釋液1∶1稀釋，加于1份分離液之液面上，1800 r/min離心25 min。棄去第1層血漿層，收集第2層細(xì)胞、第3層分離液層和第4層紅細(xì)胞層，置于含細(xì)胞洗滌液10ml的試管中，充分混勻后，1800 r/min離心30min。沉淀經(jīng)1次洗滌后用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，再經(jīng)3次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)溶物和碎片后取沉淀細(xì)胞。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測 PBS調(diào)整分離好的白細(xì)胞細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，取1ml細(xì)胞懸液，依次加入CD123－FITC抗體（ab95782，艾博抗上海貿(mào)易有限公司）和BDCA－2－PE抗體（上海微蒙生物技術(shù)有限公司），4℃避光孵育30min，加PBS 1ml離心洗滌以洗去未標(biāo)記抗體，加PBS調(diào)至200μl體積重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測（BD FACSCalibur），以WinMD 12.9軟件記錄并分析結(jié)果。

1.4白細(xì)胞的培養(yǎng)上清液分離 分離白細(xì)胞以2×106個(gè)/ml的密度接種到25m l培養(yǎng)瓶中，用RPMI1640培養(yǎng)液（上海元龍生物技術(shù)有限公司）37℃培養(yǎng)24 h。分為培養(yǎng)液單純培養(yǎng)和加入1μg/ml的BDCA－2抗體（上海微蒙生物技術(shù)有限公司）預(yù)處理2組，分別加入PBS、IFNα1b（賽諾金，深圳科興生物工程有限公司，30 μg/ml）、HSV－2 333（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒所提供，100 TCID50/ml）和寡聚脫氧核苷酸（CpG－oligodeoxynueleotide,CpG ODN）（按參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，由上海生物工程公司合成，終濃度為6μg/ml）共培養(yǎng)24 h，24 h后以1000 r/m離心10min，取上清液于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙抗體夾心ELISA檢測血清及培養(yǎng)上清液IFNα/γ 具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照IFNα/γ雙抗體夾心ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物公司）說明書進(jìn)行操作。標(biāo)準(zhǔn)品濃度按倍比稀釋。用酶標(biāo)儀在450nm處檢測吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣品濃度，結(jié)果以ng/L表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，用x±s表示。患者指標(biāo)在不同病期的變化比較用單因素重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析。外周血白細(xì)胞在IFNα等刺激下培養(yǎng)的上清液中IFNγ水平變化比較用自身配對t檢驗(yàn)，差值比較用成組t檢驗(yàn)。對照組外周血白細(xì)胞在BDCA－2抗體和IFNα等共刺激后培養(yǎng)上清液IFN γ水平的比較用單因素方差分析，多重比較用SNK法。相關(guān)數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布，組間方差齊。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同病期外周血pDCs水平變化 以對照組pDCs水平（0.511±0.131）為正常參考值，患者疾病各期pDCs百分比均低于正常參考值，靜息期和發(fā)病早期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但發(fā)病后期明顯低于前2期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 患者不同病期pDCs水平變化（n=10，x±s，%）Table 1 Changes of percentages of pDCs at different stages of genital herpes(n=10,x±s,%)

2.2 不同病期血清IFNα和IFNγ水平變化

以對照組IFNα和IFNγ水平為正常參考值，分別為（51.474±8.269）和（116.665±15.318）ng/L?；颊逫FNα水平在不同病期均高于正常參考值，發(fā)病早期高于靜息期，發(fā)病后期有所下降，但是仍高于靜息期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊逫FNγ水平在不同病期呈依次升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，靜息期略低于正常參考值，發(fā)病早期和后期均高于正常參考值（表2）。

表2 患者不同病期IFNα和IFNγ水平變化（n=10，x±s，ng/L）Table 2 Changes of serum IFNαand IFNγat different stages of genital herpes(n=10,x±s,ng/L)

2.3 IFNα、HSV－2和CpG ODN對外周血白細(xì)胞產(chǎn)IFNγ的影響 分離靜息期和對照組外周血白細(xì)胞體外培養(yǎng)24 h，ELISA分析培養(yǎng)上清液中IFNγ水平。結(jié)果顯示在加入IFNα、HSV－2和CpGODN后靜息期白細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFNγ水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 外周血白細(xì)胞分別在IFNα、HSV-2和CpG ODN刺激下培養(yǎng)上清液中IFNγ水平比較（x±s,ng/L)Table 3 Comparison of IFNγin supernate of peripheral white blood cell culture stimulated by IFNα,HSV-2 and CpG-ODN(x±s,ng/L)

2.4 BDCA－2抗體對 IFN α、HSV－2和 CpG ODN刺激外周血白細(xì)胞產(chǎn)IFNγ的影響 BDCA－2抗體可顯著抑制HSV－2組和CpG ODN組培養(yǎng)上清液中IFNγ水平，與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而BDCA－2抗體對IFNα組無影響，其上清液IFNγ水平顯著高于其余3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

3 討 論

pDCs來源于骨髓，存在于健康人血液及淋巴結(jié)組織中，皮膚組織中少見，占人外周血單核細(xì)胞的0.2%～0.8%，主要通過分泌大量IFNα參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，是其他白細(xì)胞分泌IFNα的100～1000倍[1]。pDCs內(nèi)含有體內(nèi)表達(dá)Toll樣受體7和9，結(jié)合自身核苷和病原體來源核苷，誘導(dǎo)pDCs分泌IFNα，從而發(fā)揮抗病毒作用[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)生殖器皰疹皮損真皮有pDCs浸潤，參與抗病毒免疫[2]。但本研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)性生殖器皰疹靜息期和發(fā)病早期外周血pDCs百分比與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，發(fā)病后期pDCs數(shù)量顯著減少，說明靜息期和發(fā)病早期患者外周血pDCs儲備無明顯改變，而發(fā)病后期由于HSV激活復(fù)制，迅速動(dòng)員pDCs分泌IFNα，可能存在耗竭性減少。

表4 對照組外周血白細(xì)胞在BDCA-2抗體與IFNα、HSV-2和CpG-ODN共刺激培養(yǎng)上清液中IFNγ水平比較（x±s,ng/L)Table 4 Com parison of IFNγin supernate of peripheral white blood cell culture stimulated by BDCA-2 and IFNα,HSV-2and CpG-ODN respectively in the controls(x±s,ng/L)

IFNα在人體抗病毒免疫中起重要作用，不僅直接抗病毒，也可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，目前注射及外用IFN是各種病毒性疾病治療的常用方法[7－8]。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者存在輔助性T細(xì)胞（T helper cells,Th）1和Th2細(xì)胞的失衡，表現(xiàn)為白細(xì)胞介素（interleukin,IL）－10產(chǎn)生過多，而 IFN γ及IL－2產(chǎn)生過少[9]。Mezentseva等[10]研究證明生殖器皰疹患者產(chǎn)生IFNα/γ能力明顯降低，因此復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者存在免疫失衡。本研究發(fā)現(xiàn)頻繁復(fù)發(fā)的生殖器皰疹患者靜息期外周血IFNα水平高于對照組，IFNγ水平低于對照組；IFNα水平在發(fā)病初期顯著升高，而發(fā)病后期迅速下降，IFNγ依然較對照組顯著升高。提示IFNα參與生殖器皰疹的早期免疫，而后期IFNγ進(jìn)行持續(xù)抗病毒免疫。

既往研究表明復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值降低，直接影響患者免疫狀態(tài)，是導(dǎo)致生殖器皰疹復(fù)發(fā)的一個(gè)主要原因。在抗病毒免疫中Th1通過分泌IFNγ介導(dǎo)的細(xì)胞免疫起主要作用[11－12]。研究發(fā)現(xiàn)pDCs通過分泌IFN α作用于T細(xì)胞，使T細(xì)胞向Th1分化，分泌大量的IFNγ參與機(jī)體抗病毒免疫[2]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN α、HSV－2和CpG ODN均可刺激外周血分離白細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。BDCA－2是pDCs細(xì)胞表面C型凝集素，是pDCs的一種特異性抗原，BDCA－2抗體可有效抑制pDCs產(chǎn)生IFNα/β[13]。本研究顯示BDCA－2抗體抑制HSV－2和CpGODN對外周血白細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ，而對IFNα的誘導(dǎo)作用無效，說明pDCs參與了白細(xì)胞分泌IFNγ的免疫調(diào)節(jié)。復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者外周血白細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFNγ水平顯著低于對照組，提示其Th1細(xì)胞對pDCs反應(yīng)性減低，或與患者外周血中Th1和Th2的失衡有關(guān)。

綜上所述，pDCs參與了復(fù)發(fā)性生殖器皰疹的免疫反應(yīng)，其作用機(jī)制可能是通過分泌IFNα參與早期抗病毒免疫，以及誘導(dǎo)外周血Th1分泌IFNγ參與皰疹的免疫反應(yīng)。頻繁復(fù)發(fā)的生殖器皰疹患者存在Th1淋巴細(xì)胞對pDCs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)減低。

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