姜曉龍等

摘要：從江蘇鹽城地區(qū)種植的蓖麻上采集分離到1株編號為YDJ08的病原菌。通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)研究對其進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：在PDA培養(yǎng)基上，真菌菌落形態(tài)為圓形，菌落初期為白色，后轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?，分生孢子呈梭形、薄壁、外壁光滑、無色；病原菌在蓖麻植株上接種后表現(xiàn)為木質(zhì)部變黑；ITS和β-tubulin序列分析表明該菌株與GenBank中葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的序列相似性分別高達(dá)100%和99%。綜合形態(tài)學(xué)和序列比對分析推斷該菌株為葡萄座腔菌。這是首次報(bào)道侵染蓖麻的葡萄座腔菌，該菌株的ITS和β-tubulin序列的GenBank登錄號為KJ530706、KJ530707。

關(guān)鍵詞：蓖麻；葡萄座腔菌；侵染；ITS-rDNA；β-tubulin；序列分析

中圖分類號： S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0319-04

收稿日期：2014-04-10

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：30971898）。

作者簡介：姜曉龍（1989—），男，江蘇常州人，碩士研究生，從事植物病毒和真菌病毒研究。E-mail：jiang773507166@126.com。

通信作者：陳集雙，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物真菌病毒、植物反應(yīng)器、秸稈資源化和產(chǎn)業(yè)化利用等研究。E-mail：biochenjs@163.com。葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）真菌屬于子囊菌（Ascomycota）葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）[葡萄座腔菌目（Botryosphaeriales）]，是一類重要的植物病原真菌。這類真菌分布廣泛，種類繁多，其寄主主要為具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹種，如蘋果樹、梨樹、栗子樹、桉樹等。葡萄座腔菌科真菌既能作為植物病原菌引起樹木潰瘍病，又能作為內(nèi)生真菌寄生于植物組織內(nèi)部，同時(shí)還能作為腐生真菌存活于某些死亡的植物組織上[1-3]。筆者從江蘇鹽城地區(qū)種植的疑似潰瘍病的蓖麻植株上采集、分離到1株病原真菌，命名為YDJ08。基于DNA的分子生物學(xué)研究方法發(fā)展至今已經(jīng)廣泛應(yīng)用于葡萄座腔菌屬的鑒定[4-7]，本試驗(yàn)對該菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究和分子生物學(xué)研究。通過ITS-rDNA和β-tubulin基因序列分析，證實(shí)該真菌為葡萄座腔菌，為葡萄座腔菌與蓖麻的侵染關(guān)系及其可能對蓖麻種植產(chǎn)生的影響研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試樣采集

2012年9月于江蘇海洋產(chǎn)業(yè)研究院采集疑病蓖麻植株，置于4 ℃保存。

1.2病原真菌的分離和純化

參考方中達(dá)的方法[8]，切取5 mm病健交界處的組織，先用75%乙醇處理15～20 s，然后用0.1% HgCl2處理15～20 s，最后用無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干后，置于PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，用接種針挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，純化后制成斜面，4 ℃ 保存。

1.3病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

取斜面保存的純化菌轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，28 ℃ 培養(yǎng)15 d，觀察其生長狀態(tài)并拍照記錄以下特征：菌落的生長速度、形狀、表面和邊緣特征、大小、色澤、菌落質(zhì)地、顏色以及產(chǎn)孢能力。用插片法制片觀察菌絲顯微形態(tài)。如果不產(chǎn)孢采用誘導(dǎo)的方式獲得孢子：取健康的馬尾松針或者蓖麻秸稈，剪成5 cm的小段，滅菌。配制水瓊脂培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，在表面放置3段松針或蓖麻秸稈，接入培養(yǎng)4～5 d的YDJ08菌株P(guān)DA培養(yǎng)物，28 ℃暗培養(yǎng)20 d后，置于室溫下繼續(xù)光照培養(yǎng)40 d，觀察真菌子實(shí)體的形成，再挑取子實(shí)體進(jìn)行鏡檢孢子。

1.4病原菌的致病性測定

在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盆栽蓖麻接種試驗(yàn)，供試品種為淄蓖5號。致病性測定采用菌絲餅接種法：將分離純化后的真菌接種至PDA上培養(yǎng)7 d，用滅菌打孔器在菌落邊緣取直徑為 4 mm 的菌餅。用無菌刀片將蓖麻主枝刮傷，將菌餅緊貼傷口處，用蘸有無菌水的脫脂棉和塑料膜進(jìn)行包裹，每天噴霧保濕。刮傷接種3株，空白的PDA培養(yǎng)基塊對照3株。每天觀察發(fā)病情況，取發(fā)病部位進(jìn)行顯微觀察以及發(fā)病植株重新分離病原菌并鑒定。

1.5真菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1真菌基因組的提取將純化的菌絲接種于PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3 d。過濾收集菌絲體，冷凍干燥，通過改良的CTAB法提取真菌基因組DNA[9]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取結(jié)果，DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2真菌ITS-rDNA和β-tubulin基因序列分析以基因組DNA為模板，采用核糖體基因組轉(zhuǎn)錄通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增[10]，用真菌微管蛋白基因序列通用引物Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）進(jìn)行β-tubulin基因序列擴(kuò)增[11]。ITS擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：超純水37.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，20 μmol/L ITS4和ITS5引物各1 μL，模板DNA （50 ng/μL）1 μL，2.5 μmol/L dNTP 4 μL，5 U/μL rTaq DNA 聚合酶 0.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物4 ℃保存；β-tubulin擴(kuò)增條件同ITS擴(kuò)增條件。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測拍照后，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行回收純化，具體步驟參見使用說明書。純化后的產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測得序列在NCBI中使用Blast在線比對分析，使用 ClustalW 進(jìn)行多重比對，NJ（Neighbour-Joining）進(jìn)化樹構(gòu)建與分析使用MEGA 5.1軟件。endprint

2結(jié)果與分析

2.1菌落形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀

分離純化的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則形，菌落生長初期為白色，3～4 d即可長滿直徑9 cm的平板，5～6 d后變?yōu)榛疑?5 d后變?yōu)楹谏瑲馍z比較發(fā)達(dá)，旺盛時(shí)可至平板頂蓋出（圖1）。

從光學(xué)顯微鏡下可以看到菌絲直徑為3～5 μm，分枝與主枝成直角，部分成銳角，有明顯的隔膜（圖2-A、圖2-B），但是在顯微鏡下未見有分生孢子產(chǎn)生。用滅菌的松針和蓖麻秸稈經(jīng)10 d培養(yǎng)后可誘導(dǎo)其產(chǎn)生子實(shí)體。

誘導(dǎo)出的子實(shí)體個(gè)體較大，直徑有1～3 mm，形狀為球形，多為表生，濕度較大時(shí)，子實(shí)體還會有褐色的液體物質(zhì)溢出（圖2-C、圖2-D）。據(jù)報(bào)道葡萄座腔菌能產(chǎn)生分生孢子，分子孢子呈紡錘形或者梭形，無色，單胞，內(nèi)含多個(gè)不規(guī)則油滴，也有不產(chǎn)生孢子的[12]。菌株YDJ08在PDA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生子實(shí)體后，在光學(xué)顯微鏡下可以看到分生孢子：分生孢子體呈球形，黑色（圖2-E）；分生孢子呈梭形、薄壁、外壁光滑、有3～5個(gè)隔、無色、分生孢子大小范圍 （15～30） μm×（5～10） μm（圖2-F）。根據(jù)以上形態(tài)特征，初步判定其為葡萄座腔菌。

2.2致病性測定結(jié)果

將菌株YDJ08以菌絲餅接種法對健康蓖麻植株進(jìn)行致病性測定。結(jié)果表明，共接種3株，2株發(fā)病輕微，1株發(fā)病較重。沒有接菌的淄蓖5號的試驗(yàn)部位出現(xiàn)了一些被手術(shù)刀劃傷的痕跡，沒有其他的現(xiàn)象，接種菌餅的主枝上3 d產(chǎn)生黑褐色斑點(diǎn)，經(jīng)7 d左右枝條變成黑褐色，有潰爛現(xiàn)象（圖3）。從接種發(fā)病的主枝的病健交界處取發(fā)病組織重新分離純化，發(fā)現(xiàn)重新分離的病原菌與接種的菌株菌落形態(tài)和孢子形態(tài)完全一致。因此，可以判斷葡萄座腔菌對蓖麻有致病性。

2.3ITS-rDNA和β-tubulin序列分析

提取的基因組DNA條帶單一明亮，擴(kuò)增效果較好（圖 4-A）。ITS-rDNA擴(kuò)增序列包括18S和28S部分序列以及ITS1、ITS2和5.8S的全部序列[13]，一般大小在500～1 000 bp之間，本試驗(yàn)測得的ITS大小為559 bp（圖4-B），GenBank登錄號為KJ530706。β-tubulin擴(kuò)增序列大小為413 bp（圖4-C），GenBank上的登錄號為KJ530707。

將所測序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTN比對，前100條相似的序列全部屬于葡萄座腔菌的ITS區(qū)段 同源性在

99%～100%，覆蓋率為 99%～100%。由于同源性很高，僅選取幾種有代表性的菌株進(jìn)行進(jìn)化樹分析，同時(shí)選取同為葡萄座腔菌科的格孢腔菌屬的ITS序列進(jìn)行外族比對。所選取的序列用ClustalW進(jìn)行多級比對之后，用MEGA 5.1軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹（圖5）。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示菌株YDJ08與葡萄座腔菌在同一分支內(nèi)，格孢腔菌屬真菌則獨(dú)立成簇。

將所測β-tubulin序列在GenBank中進(jìn)行BLASTP比對，相似性序列全部來源于Botryosphaeria，相似性高達(dá)99%～100%，覆蓋率也高達(dá)99%～100%，有同源性的還有葡萄座腔菌科球殼孢目葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）真菌。根據(jù)ITS構(gòu)建進(jìn)化樹的方法，選取同為葡萄座腔菌科的格孢腔菌屬的β-tubulin序列進(jìn)行比對，用MEGA 5.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹（圖6）。進(jìn)化樹分析顯示YDJ08與葡萄座腔菌同為一簇。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、ITS以及β-tubulin序列比對結(jié)果，證實(shí)從蓖麻上分離的真菌YDJ08是葡萄座腔菌。

進(jìn)化樹構(gòu)建采用NJ方法，每個(gè)節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字代表1 000次Bootstrap重復(fù)中支持該節(jié)點(diǎn)方式的百分比，Bootstrap<50%的未顯示。

3結(jié)論與討論

葡萄座腔屬真菌自從發(fā)現(xiàn)以來一直作為植物病原菌被廣泛研究，由于其分布廣泛，發(fā)病率高，經(jīng)常給生態(tài)和經(jīng)濟(jì)林木造成嚴(yán)重的損失。楊樹潰瘍病是由葡萄座腔菌引起的一類最常見的病害[13]，國內(nèi)最早的報(bào)道是1955年發(fā)生在北京某苗圃，癥狀主要發(fā)生在大枝和主干上，發(fā)病初期會在光皮楊樹樹皮上形成許多近圓形小泡狀的病斑，隨后病斑逐漸增大至直徑1 cm左右，形成圓形小泡。用手按壓小泡有無色液體流出；在粗皮楊樹上則形成水漬狀病斑并伴有紅褐色液體流出，后期病斑失水干癟，形成一個(gè)圓形、黑褐色的壞死斑。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病斑布滿整個(gè)樹干，最后枯死[14-17]。葡萄座腔菌屬真菌引起的梨輪紋病和蘋果輪紋病也是常見的果樹類病害，梨輪紋病發(fā)生的部位包括枝干、果實(shí)、葉片，都會產(chǎn)生圓形的病斑，并逐漸擴(kuò)大，引起樹枝干枯，葉片干枯早落，果實(shí)腐敗[18]，何開平等對梨輪紋病的發(fā)病規(guī)律進(jìn)行了研究并提出了較好的預(yù)防措施[19-20]，但未見有相關(guān)報(bào)道稱其引起蓖麻產(chǎn)生危害。本研究從疑似病癥的蓖麻上分離得到1株葡萄座腔菌，通過病原菌致病力測定，發(fā)現(xiàn)其對蓖麻會產(chǎn)生類似的潰瘍病病害，

枝干變黑，潰爛。本研究結(jié)果以期望對其可能引起的蓖麻病害提供一定理論基礎(chǔ)。

用分子生物學(xué)方法鑒定真菌隨著基因技術(shù)的發(fā)展也越來越普及。余仲東等就用真菌的生理形態(tài)結(jié)合ITS-rDNA技術(shù)分析來自我國的蘋果輪紋病菌、蘋果干腐病菌、梨輪紋病菌、桃樹流膠病菌，并認(rèn)定這些病菌和葡萄座腔菌親緣關(guān)系近，結(jié)果支持葡萄座腔菌與貝倫格葡萄座腔菌（B. berengeriana）為同物異名的觀點(diǎn)[5]。Slippers等利用ITS-rDNA、β-tubulin等分子生物學(xué)技術(shù)比較澳大利亞和南非當(dāng)?shù)氐蔫駱淦贩N和外來品種相關(guān)的葡萄座腔菌屬，并確定了5個(gè)Fusicoccum-like無性型種：B. australis、B. dothidea、B. eucalypticola、B. eucalyptorum和B. parva，卻未得到之前常見報(bào)道于桉樹上存在的B. ribis[21]。Denman等利用形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA 序列確定了感染山龍眼的5個(gè)葡萄座腔菌屬，并解析了它們在全球的分布，但該研究報(bào)道的某些種實(shí)際是代表一個(gè)種的復(fù)合體[22]。由于葡萄座腔屬真菌跟其宿主和分布有著廣泛的關(guān)系，僅從形態(tài)學(xué)不能完全解釋清楚真菌種群之間的相互關(guān)系，有必要結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)遺傳進(jìn)化特征對其進(jìn)行更科學(xué)、更準(zhǔn)確的分類。endprint

葡萄座腔菌引起的蓖麻病害尚未見報(bào)道，本研究從發(fā)病蓖麻植株上分離得到1株真菌，采用ITS-rDNA和β-tubulin基因序列分析，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征對葡萄座腔屬真菌進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定，同時(shí)作了致病力測定，發(fā)現(xiàn)其確實(shí)會對蓖麻產(chǎn)生病害，最終確定此植物病原菌為葡萄座腔菌。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pavlic D，Slippers B，Coutinho T A，et al. Botryosphaeriaceae occurring on native Syzygium cordatum in South Africa and their potential threat to eucalyptus[J]. Plant Pathology，2007，56（4）：624-636.

[2]Sandra D W，Taylor J E，Kang J C，et al. An overview of the taxonomic history of Botryosphaeria，and a re-evaluation of its anamorphs based on morphology and ITS rDNA phylogeny[J]. Studies in Mycology，2000（45）：29-140.

[3]Slippers B，Wingfield M J. Botryosphaeriaceae as endophytes and latent pathogens of woody plants：diversity，ecology and impact[J]. Fungal Biology Reviews，2007，21（2）：90-106.

[4]陳劍山，鄭服叢. ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（13）：3785-3786，3792.

[5]余仲東，趙官成，淡靜雅，等. 葡萄座腔菌屬ITS-nrDNA的分子系統(tǒng)學(xué)分析[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2010，29（2）：285-293.

[6]Mohali S R，Slippers B，Wingfield M J. Identification of Botryosphaeriaceae from eucalyptus，acacia and pinus in Venezuela[J]. Fungal Diversity，2007，25（25）：103-125.

[7]Slippers B，Smit W A，Crous P W，et al. Taxonomy，phylogeny and identification of Botryosphaeriaceae associated with pome and stone fruit trees in South Africa and other regions of the world[J]. Plant Pathology，2007，56（1）：128-139.

[8]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：122-145.

[9]Raeder U，Broda P. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi[J]. Letters in Applied Microbiology，1985，1（1）：17-20.

[10]劉春來，文景芝，楊明秀，等. rDNA-ITS在植物病原真菌分子檢測中的應(yīng)用[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（1）：101-106.

[11]Slippers B，Crous P W，Denman S，et al. Combined multiple gene genealogies and phenotypiccharacters differentiate several species previously identified as Botryosphaeria dothidea[J]. Mycologia，2004（96）：83-101.

[12]徐成楠，周宗山，遲福梅，等. 越橘葡萄座腔菌枝枯病的病原菌鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（2）：231-236.

[13]趙杰. ITS序列分析及其在植物真菌病害分子檢測中的應(yīng)用[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（4）：35-37.

[14]張星耀，駱有慶，王鴻斌.中國森林重大生物災(zāi)害[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2003：93-139.

[15]鐘兆康. 幾種楊樹潰瘍病的識別與防治[J]. 林業(yè)科技通訊，1985（6）：28-31.

[16]王云飛，郭勇，朱百忍. 楊樹潰瘍病的發(fā)病癥狀及防治技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（21）：83.

[17]王義勛，陳京元，蔡三山，等. 楊樹潰瘍病研究進(jìn)展[J]. 湖北林業(yè)科技，2008（3）：39-41，50.

[18]李明桃. 梨輪紋病的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（4）：25-28.

[19]何開平，張俊偉，吳楚. 梨輪紋病研究進(jìn)展[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2013，33（6）：21-25.

[20]田路明，周宗山，董星光，等. 梨輪紋病研究進(jìn)展[J]. 中國果樹，2013（4）：74-77.

[21]Slippers B，F(xiàn)ourie G，Crous P W，et al. Speciation and distribution of Botryosphaeria spp. on native and introduced eucalyptus trees in Australia and South Africa[J]. Studies in Mycology，2004，50：343-358.

[22]Denman S，Crous P W，Groenewald J Z，et al. Circumscription of Botryosphaeria species associated with proteaceae based on morphology and DNA sequence data[J]. Mycologia，2003，95（2）：294-307.孫丹，支崇遠(yuǎn)，李婭. 烏江上游畢節(jié)段溶洞地下水浮游硅藻及水質(zhì)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：323-326.endprint