李元新，劉來(lái)利，王必成，張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000）

硒是人體和動(dòng)物所必需的的微量元素，可用于癌癥的化學(xué)預(yù)防，并且具有抗氧化和抗突變的作用，但較高濃度的硒亦有一定毒性。目前硒的遺傳毒性報(bào)告較少。為了探討亞硒酸鈉的安全性，通過(guò)亞硒酸鈉哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)對(duì)其的致突變性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 受試物及其對(duì)照品

試驗(yàn)時(shí)配制方法：稱取亞硒酸鈉0.04202g，用滅菌純化水溶解，配制成4.20μg／mL（IC50），2.10 μg／mL（1／2IC50）和1.050μg／mL（1／4IC50）濃度。注射用絲裂霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），批號(hào)：111117，試驗(yàn)時(shí)配成12.5g／mL 溶液。注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）批號(hào)：12042425，試驗(yàn)時(shí)配制成1mg／mL的溶液。

1.2 主要試劑

胰蛋白酶（Sigma，批號(hào)：0458）；乙二胺四乙酸二鉀（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20110127）；MEM 培養(yǎng)液（成都哈里生物工程有限公司，批號(hào)20120805）；新生牛血清（成都哈里生物工程有限公司，批號(hào)：120510）；注射用青霉素鈉（80 萬(wàn)單位，華北制藥股份有限公司，批號(hào)：S1107304）；注射用硫酸鏈霉素（100萬(wàn)單位，華北制藥股份有限公司。批號(hào)：1111106）；葡萄糖－6－磷酸二鈉（Sigma生產(chǎn)，批號(hào)：G－7250）；NADP（Sigma，批號(hào)：004669），苯酚紅（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20120501）；秋水仙素（上海藍(lán)劑科技發(fā)展有限公司。批號(hào)：051212）；姬 姆 薩 染 料（Sigma 生 產(chǎn)，批 號(hào)：G－4507），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽消毒器（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；XDS－1B 倒置顯微鏡（重慶麥克光電儀器有限公司）；311二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)THERMO FORMA 公司）；NT 系列凈化工作臺(tái)（吳江市金樂凈化設(shè)備廠）；水浴鍋（上海寶磊儀器有限公司，型號(hào)：HH－S24S）；0406－1臺(tái)式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠）；XB－K－25血球計(jì)數(shù)板（玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠）；YDS－35－80液氮罐（四川亞西橡塑機(jī)器有限公司），XSZ－7G 雙目生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；BS124S電子天平（德國(guó)Sartorius股份有限公司出品）；AUW120D 型電子天平（日本島津公司出品）。

1.4 細(xì)胞株

選用中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL 細(xì)胞）對(duì)供試品進(jìn)行檢測(cè)，購(gòu)自中科院昆明細(xì)胞庫(kù)，需定期檢查是否有支原體等污染，液氮保存，按常規(guī)要求復(fù)蘇、接種和傳代細(xì)胞。

2 試驗(yàn)方法

2.1 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞（CHL）染色體畸變?cè)囼?yàn)

根據(jù)《根據(jù)遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，3個(gè)亞硒酸鈉濃度組，分別為4.20g／mL（IC50），2.10g／mL（1／2IC50）和1.05g／mL（1／4IC50）。并同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組為純化水，陽(yáng)性對(duì)照組在未加S9mix用絲裂霉素（22h的濃度為0.25g／mL，接觸6h的濃度為0.5g／mL），加S9mix用環(huán)磷酰胺（終濃度為20 g／mL）。以上5組受試物均用滅菌純化水配制。將生長(zhǎng)旺盛的CHL 細(xì)胞用胰蛋白酶液消化，用含10%的新生牛血清MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液制備成（1～2）×104個(gè)／mL的細(xì)胞懸液，按每瓶（25cm2規(guī)格）接種5mL，每組3個(gè)平行，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4.5mL含不同濃度受試物溶液或陰性、陽(yáng)性對(duì)照液，需活化時(shí)每年瓶加S9混合液0.5 mL，不需要活化時(shí)每年瓶加0.5 mLMEM 培養(yǎng) 液，繼 續(xù) 置37 ℃、5%CO2培 養(yǎng) 箱 培養(yǎng)6h，用PBS洗滌3次，各組再加入5.0mLMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱再培養(yǎng)16h，與作用22h的細(xì)胞同時(shí)收獲。收獲細(xì)胞前2h，加入秋水仙素使細(xì)胞分裂停止于中期分裂相，按常規(guī)方法制片、染色。每份標(biāo)本觀察200個(gè)中期分裂相細(xì)胞，用油鏡計(jì)染色體畸變數(shù)目并記錄畸變類型。

2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，采用Excel軟件計(jì)算平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差，判斷數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布，正態(tài)分布則采用Excel中F 檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后選擇t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若呈非正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果及分析

3.1 試驗(yàn)結(jié)果

表1 亞硒酸鈉對(duì)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

表1結(jié)果顯示，亞硒酸鈉在加S9混合物（活化條件）和不加S9混合物（非活化條件）時(shí)，高劑量組和中劑量組的畸變率與溶媒對(duì)照組比較有顯著差異性（P＜0.01），畸變率均高于5%且畸變率高低與供試品濃度有依賴性，為陽(yáng)性結(jié)果；低劑量組的畸變率與溶媒對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），畸變率均低于5%，為陰性結(jié)果。

3 討論

染色體畸變是環(huán)境有害因素作用于機(jī)體或培養(yǎng)的細(xì)胞后所致最常見的遺傳物質(zhì)損傷之一，反映的遺傳學(xué)終點(diǎn)是染色體分離改變和染色體完整性改變。目前，在實(shí)驗(yàn)研究中，多用各種細(xì)胞系（株）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察與分析染色體的改變，其中中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞（CHL）是常用的細(xì)胞株之一，它能在體外穩(wěn)定傳代細(xì)胞株，自發(fā)突變率低，對(duì)許多化學(xué)物的作用敏感，染色體數(shù)目正常非突變型為25條，由于染色體數(shù)目少，便于分析，被廣泛用于染色體畸變?cè)囼?yàn)的研究。

亞硒酸鈉在1.05～4.20μg／mL 的劑量下，在加或不加代謝活化劑條件下與CHL 細(xì)胞作用，4.20μg／mL，2.10μg／mL劑量可誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體畸變率增高，提示在本實(shí)驗(yàn)條件下具有致突變性，1.05μg／mL劑量沒有誘發(fā)CHL 細(xì)胞染色體畸變率增高和染色體損傷的能力。

［1］ 藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（第二稿）［S］.2006.

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