章 典，李 誠，劉 璐，張勝娟，張庭廷

安徽師范大學生命科學學院; 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室, 蕪湖 241000

巖蘭草油對淡水藻類的抑制作用

章 典，李 誠，劉 璐，張勝娟，張庭廷*

安徽師范大學生命科學學院; 生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室, 蕪湖 241000

利用植物分泌的化感物質進行藻類控制已成為國內外生態(tài)環(huán)境領域研究的熱點之一。首次探討了巖蘭草油的抑藻效應，建立了巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻兩種藻共培養(yǎng)時抑制作用的數(shù)學模型，采用GC-MS分析方法對巖蘭草油中主要成分進行了鑒定。結果表明：巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻在單獨和共培養(yǎng)狀態(tài)下均有良好的抑制作用，對單獨培養(yǎng)的銅綠微囊藻和斜生柵藻抑制作用的EC50分別為0.20和0.30 mL/L，說明巖蘭草油對藍藻(銅綠微囊藻)的抑制效果明顯好于對綠藻(斜生柵藻)。巖蘭草油的主要成分為具有良好抑藻作用的倍半萜類物質，而所建立的巖蘭草油對兩藻共培養(yǎng)狀態(tài)下抑制作用的數(shù)學模型可以求出在任何時間節(jié)點上銅綠微囊藻和斜生柵藻的種群密度以及要達到抑藻最佳狀態(tài)的巖蘭草油濃度。該研究對水華藻類的控制有較重要的理論與應用價值。

巖蘭草油; 銅綠微囊藻; 斜生柵藻; 化感物質; 數(shù)學模型

水體富營養(yǎng)化導致的藻類過度增殖，水華頻繁發(fā)生，對水生生態(tài)系統(tǒng)和水體景觀帶來了嚴重的影響。尤其是水華藻類釋放的藻毒素，可以溶解在水中，通過食物鏈等方式最終影響人類的健康和生活。因此，有效控制藻類過度生長及防止水華暴發(fā)是目前環(huán)境和生態(tài)領域中最為關注的問題。

近十年來，水生植物化感作用抑藻研究得到了廣泛認可，因水生植物普遍生長于水中，且容易栽種，其釋放的化感物質大多為次生代謝產物，在自然環(huán)境下可以短期降解，具有生態(tài)危險性低、副作用小、抑制效果明顯等優(yōu)點，因此成為實現(xiàn)藻類安全控制的新方法[1]。在水體中直接栽種水生植物抑藻的基礎上，從水生植物體內提取化感物質將其直接施入水體，可以快速抑制藻類生長，并且易于操作，特別是為不適宜種植水生植物的水域提供極大便利[2]。

巖蘭草 (Vetiveriazizanioides) 屬禾本科巖蘭草屬，是一種多年生兩棲類草本植物。其根系特別發(fā)達，可延伸到地下3 m，在惡劣的環(huán)境中仍然可以存活[3-4]。其龐大的根系不僅可富集重金屬，快速吸收水體中的氮磷，還可分泌化感物質殺滅水體中的有害微生物[5-7]。

為了尋找到能有效抑藻的化感物質，本文探討了巖蘭草根提取物巖蘭草油(vetiver oil)在單獨和共培養(yǎng)方式下對水華藍藻銅綠微囊藻 (Microcystisaeruginosa) 和常見綠藻斜生柵藻 (Scenedesmusobliquus) 生長的影響，并分析了巖蘭草油的主要成分，旨在為水華藍藻治理尋找一條安全、環(huán)保、有效的新思路，新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

巖蘭草油購自湖北佳諾信生物化工有限公司，純度>99%。

銅綠微囊藻和斜生柵藻由中國科學院水生生物研究所藻種庫提供；銅綠微囊藻采用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，斜生柵藻采用HB-4培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)方法

實驗前1周，兩種藻分別進行擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：光照強度4000 lx，光暗比為12 h∶12 h，溫度 (25±1) ℃。每天搖動3—5 次，使藻細胞進入對數(shù)生長期。

1.3 實驗設計

1.3.1 巖蘭草油對單獨培養(yǎng)的銅綠微囊藻和斜生柵藻的抑制作用

在預實驗的基礎上進行抑藻實驗。取對數(shù)生長期的銅綠微囊藻和斜生柵藻分別放入50 mL錐形瓶中，再加入培養(yǎng)基使其藻細胞最終濃度為3.5×105個/mL，并使最終體積為20 mL。錐形瓶中巖蘭草油的最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8 mL/L，每組設3 個平行，各組置于1.2相同條件下培養(yǎng)。每隔48 h 進行細胞計數(shù)。

1.3.2 巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻共培養(yǎng)時的抑制作用

將對數(shù)生長期的銅綠微囊藻和斜生柵藻用培養(yǎng)基稀釋至最終濃度2.5×105個/mL，然后分別取10 mL的藻液共同倒入50 mL錐形瓶。錐形瓶中巖蘭草油最終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 mL/L，每組設3個平行，培養(yǎng)條件與1.2相同，共培養(yǎng)10 d。每隔48 h細胞計數(shù)。

1.3.3 巖蘭草油的成分分析

對巖蘭草油進行氣質聯(lián)用(GC-MS)分析。氣相色譜條件為：進樣口溫度260 ℃氣化，流速1.50 mL/min，分流比100∶1，柱類型RTX-5，30×0.25×0.25，升溫程序初始溫度40 ℃，保持2 min后，在10 ℃/min速度下加熱至250 ℃，保持5 min；質譜條件為：離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，檢測器電壓0.81 kV，掃描間隔時間0.5 sec，掃描荷質比40—700 aum，進樣體積1 μL。應用NIST質譜數(shù)據(jù)庫，分析質譜圖，鑒定巖蘭草油中主要化學成分。

1.4 測定方法

細胞計數(shù)使用血細胞計數(shù)板計數(shù)；巖蘭草油成分分析使用島津GC-MS QP2010plus氣質聯(lián)用儀。

1.5 數(shù)據(jù)處理

巖蘭油對藻類的抑制率公式為：

IR= (1-N/N0)×100%

式中，IR為抑制率；N為加入巖蘭草油組的藻密度(個/mL)；N0為對照組藻密度 (個/mL)。將巖蘭草油濃度與生長抑制率作一元線性回歸，求出半效應濃度EC50(mL/L)。

數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 17.0軟件處理，各組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 巖蘭草油對單獨培養(yǎng)的銅綠微囊藻和斜生柵藻生長的影響

由圖1可知巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻均有較好的抑制作用，且具有時間和劑量相關性。如各處理組在第2天內變化不大，從第4天 開始表現(xiàn)出不同的變化趨勢，在第10天時，最大濃度處理組與對照組差異相當明顯 (P<0.01)。兩種藻對照組與0.1 和0.2 mL/L處理組均無顯著差異 (P>0.05)，說明低濃度巖蘭草油對兩種藻雖表現(xiàn)抑制但抑制效果不明顯，0.4 mL/L處理組對斜生柵藻抑制作用明顯 (P<0.05)，0.8 mL/L處理組對斜生柵藻有極其顯著的抑制作用 (P<0.01)；而0.4和0.8 mL/L處理組對銅綠微囊藻的抑制作用均非常明顯 (P<0.01)，通過比較巖蘭草油對兩種藻的EC50，證明了巖蘭草油抑藻具有種屬選擇性，對銅綠微囊藻的抑制效果要好于斜生柵藻。

圖1 不同濃度巖蘭草油對銅綠微囊藻(A)和斜生柵藻(B)生長的影響Fig.1 Effect of vetiver oil on the growth of Microcystis aeruginosa (A) and Scenedesmus obliques (B) at different concentration

2.2 不同濃度巖蘭草油對兩種藻類的生長抑制率

由表1 和表2 可見，巖蘭草油對兩種藻均有抑制作用，隨著巖蘭草油濃度的升高，抑制率也逐漸增大。比較兩種藻抑制率，發(fā)現(xiàn)在所有濃度的處理組中，巖蘭草油對銅綠微囊藻的抑制率均大于斜生柵藻。在第8天時，當巖蘭草油濃度為0.4 mL/L時，對銅綠微囊藻的抑制率已經達到95.67%，而斜生柵藻在巖蘭草油濃度為0.8 mL/L時抑制率才達到84.21%。EC50均按第10天計算，得出巖蘭草油對銅綠微囊藻的EC50接近0.20 mL/L，而對斜生柵藻的EC50為0.30 mL/L，進一步說明了巖蘭草油對銅綠微囊藻的抑制效果更好，可能是兩種藻的細胞結構不同對巖蘭草油的敏感性有差異。

表1 巖蘭草油對銅綠微囊藻的抑制率/%Table 1 Inhibition ratios of Microcystis aeruginosa by vetiver oil

表中數(shù)據(jù)為平均值±SE(n=3)

表2 巖蘭草油對斜生柵藻的抑制率/%Table 2 Inhibition ratios of Scenedesmus obliques by vetiver oil

表中數(shù)據(jù)為平均值±SE(n=3)

2.3 不同濃度巖蘭草油對兩種藻共培養(yǎng)環(huán)境下生長的影響

從圖2可以看出，巖蘭草油對兩種藻均具有抑制效果。但對照組中銅綠微囊藻的數(shù)目明顯多于斜生柵藻(P<0.05)，而在實驗組中第6天時的斜生柵藻細胞數(shù)目明顯高于銅綠微囊藻(P<0.05)。對照組現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是：(1)斜生柵藻的增長速度小于銅綠微囊藻；(2)銅綠微囊藻釋放出化感物質抑制了斜生柵藻的生長，所以對照組中銅綠微囊藻細胞密度大于斜生柵藻；但實驗組中，由于巖蘭草油的逐漸作用，至第6天時的銅綠微囊藻的細胞密度顯著小于斜生柵藻，這更加說明了巖蘭草油對銅綠微囊藻的抑制效能高于斜生柵藻。

圖2 巖蘭草油對兩種藻共培養(yǎng)時生長的影響Fig.2 Effect of vetiver oil on the growth of two species of algae with mixed culture

為了更好地利用巖蘭草油進行藻華的控制，在圖2數(shù)據(jù)的基礎上，參見文獻[8-9]擬合了巖蘭草油對銅綠微囊藻與斜生柵藻共存時的抑制模型。巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻共存時的抑制模型與銅綠微囊藻、斜生柵藻單獨生長的模型、以及在巖蘭草油抑制環(huán)境下銅綠微囊藻、斜生柵藻單獨生長時的模型既有區(qū)別，又有聯(lián)系。在銅綠微囊藻、斜生柵藻單獨生長時藻的總量具有有限增長特點的基礎上，考慮到共存條件下兩種藻的相互作用，以及在巖蘭草油抑制環(huán)境下兩種藻的相互作用，在傳統(tǒng)的Logistic模型的基礎上，增加了巖蘭草油抑制條件下銅綠微囊藻與斜生柵藻彼此競爭的作用項，以及巖蘭草油對銅綠微囊藻以及斜生柵藻的抑制項。

根據(jù)1 mL/L巖蘭草油對銅綠微囊藻與斜生柵藻共存時的實驗數(shù)據(jù)，擬合出1 mL/L巖蘭草油對銅綠微囊藻與斜生柵藻共存時的抑制模型為：

式中，x(t)是銅綠微囊藻在t時刻的密度，y(t)是斜生柵藻在t時刻的密度。根據(jù)該模型可以求出在任何時間節(jié)點上銅綠微囊藻和斜生柵藻的種群密度以及要達到抑藻最佳狀態(tài)的巖蘭草油濃度。

2.4 巖蘭草油化感物質鑒定

通過GC-MS分析鑒定出巖蘭草油中的主要化學成分為8種含量較高的倍半萜烯類物質(圖3，圖4)，此外還有醇和酮，分別為1-環(huán)己基-丁酮、松油醇、雪松醇、花側柏烯、α-花柏烯、δ-杜松萜烯、α-芳姜黃烯、β-雪松烯。萜類化感物質是第二大類化感物質，具有很強的化感作用，很多萜類物質具有非常好的抑藻效果[10-11]。

圖3 巖蘭草油總離子流程圖Fig.3 Total ionization chromatograph of vetiver oil

圖4 巖蘭草油中幾種主要化感物質Fig.4 Several primary chemical substance in vetiver oil

3 討論

高等水生植物的化感作用普遍存在于自然界中，但作用效果不盡相同，可解釋為不同的植物對另外一種植物有不同的化感作用強度，也可能為同一種植物對不同植物有不同的作用效果。在利用高等水生植物抑藻的研究中，許多結論證明了將水生植物中的有效成分提取出來后，有很好的抑藻效果。如Zhang等[12-13]分離了普生輪藻以及窄葉香蒲中的化感物質，鑒定了其主要成分分別為脂肪酸類以及酚酸類化感物質，并證明了其對銅綠微囊藻的強烈化感抑制作用；胡光濟等使用菖蒲干體提取液對銅綠微囊藻和蛋白核小球藻進行抑藻研究，發(fā)現(xiàn)在相同提取液濃度下，銅綠微囊藻受到的抑制作用比蛋白核小球藻明顯[14]。這些證據(jù)不僅證明了水生植物抑藻的有效性，同時也發(fā)現(xiàn)了水生植物的化感作用具有選擇性。

本實驗結果表明，高等兩棲植物巖蘭草的提取物巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻均具有良好的抑制效應，而且對銅綠微囊藻的抑制效果要明顯好于對斜生柵藻，這個現(xiàn)象再次證明了水生植物化感作用的選擇性，而這種選擇性在實際中具有很可觀的應用價值。同時，在單獨抑藻實驗的基礎上，本實驗還開展了對共培養(yǎng)狀態(tài)下的抑藻研究。結果表明，對照組的共培養(yǎng)體系中，銅綠微囊藻占據(jù)種群優(yōu)勢，斜生柵藻的細胞數(shù)量較低，這與天然水體銅綠微囊藻占據(jù)優(yōu)勢可能具有某些相似的機制；而在巖蘭草油的作用下，因化感物質抑藻具有選擇性，斜生柵藻至作用第6天時占據(jù)優(yōu)勢，進一步說明巖蘭草油對銅綠微囊藻的抑制作用強于對斜生柵藻，這在普遍存在的以銅綠微囊藻為絕對優(yōu)勢種群的實際水體的應用具有一定的可行性。

巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻共培養(yǎng)時的抑藻模型是根據(jù)實驗室特定條件下的試驗結果建立起來的藻類生長動力學模型，是對化感物質抑藻的一種定量分析以及對復合化感物質對混合藻類抑藻過程的簡化、理想化后建立起來的，具有一定的通用性和精確性。然而所構建的模型所包含的因子還不豐富，還有一些因素被忽略、簡化，如真實水體中藻類生長會受到營養(yǎng)鹽濃度、溫度、水動力條件等因素的影響，這些尚需在以后的研究中逐一論證，因此該模型的通用性和精確性是相對的和近似的，要將該模型應用于真正的生態(tài)系統(tǒng)中，還需要進一步的驗證、分析以及綜合討論。

另外，在本研究過程中，曾將巖蘭草油通過不同有機溶劑進行進一步的純化，發(fā)現(xiàn)純化后的巖蘭草油抑藻效果反而較純化前差，這提示巖蘭草油的抑藻作用可能是其復合化感物質起協(xié)同抑制作用的結果。巖蘭草油GC-MS分析表明，其主要成分為萜類物質。根據(jù)巖蘭草油主要化感物質的結構(大多具有雙鍵，尤其是有些還具有共軛雙鍵)以及實驗現(xiàn)象推測巖蘭草油抑藻的機制可能涉及到葉綠素的破壞、自由基的產生以及細胞結構的改變等[15-16]，具體將有待進一步深入研究。

4 結論

(1) 巖蘭草油具有良好的抑藻效果 巖蘭草油對銅綠微囊藻和斜生柵藻在單獨和共培養(yǎng)狀態(tài)下均有良好的抑制作用，對單獨培養(yǎng)的銅綠微囊藻和斜生柵藻抑制作用的EC50分別為0.20和0.30 mL/L，表明巖蘭草油對銅綠微囊藻的抑制效果明顯好于對斜生柵藻。

(2) 巖蘭草油的主要成分為倍半萜類物質 如1-環(huán)己基-丁酮、松油醇、雪松醇、花側柏烯、α-花柏烯、δ-杜松萜烯、α-芳姜黃烯、β-雪松烯等。在化感作用研究中，萜類物質是重要的化感物質，對于這幾種萜類物質各自化感抑藻作用強度及其機制將在后續(xù)進一步進行研究。

(3) 所建立的巖蘭草油對兩藻共培養(yǎng)狀態(tài)下抑制作用的數(shù)學模型可以求出在任何時間節(jié)點上銅綠微囊藻和斜生柵藻的種群密度以及要達到抑藻最佳狀態(tài)的巖蘭草油濃度，具有一定的通用性和精確性。

[1] Hu H Y, Men Y J, Li F M. Research progress on phyto-allelopathic algae control. Ecology and Environment, 2006, 15(1): 153-157.

[2] Vyvyan J R. Allelochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals. Tetrahedron, 2002, 58(9): 1631-1646.

[3] Truong P, McDowell M, Christiansen I. Stiff grass barrier with vetiver grass-a new approach to erosion and sediment control in Australia//Hunter H M, Eyles A G, Rayment G E, eds. Downstream Effects of Land Use. Queensland, Australia: Department of Natural Resources, 1995: 301-304.

[4] Chen H M, Zheng C R, Tu C, Shen Z G. Chemical methods and phytoremediation of soil contaminated with heavy metals. Chemosphere, 2000, 41(1/2): 229-234.

[5] Angin I, Turan M, Ketterings Q M, Cakici A. Humic acid addition enhances B and Pb phytoextraction by Vetiver grass (Vetiveriazizanioides(L.) Nash). Water, Air, & Soil Pollution, 2008, 188(1/4): 335-343.

[6] Srivastava J, Chandra H, Singh N. Allelopathic response ofVetiveriazizanioides(L.) Nash on members of the familyEnterobacteriaceaeandPseudomonasspp. The Environmentalist, 2007, 27(2): 253-260.

[7] Srivastava J, Kayastha S, Jamil S, Srivastava V. Environmental perspectives ofVetiveriazizanioides(L.) Nash. Acta Physiologiae Plantarum, 2008, 30(4): 413-417.

[8] 何宗祥, 張庭廷. 四種十八碳脂肪酸抑藻時-效關系分析的數(shù)學模型設計.生態(tài)學報, 2011,31 (23):7235-7243.

[9] 何宗祥, 張庭廷. 兩種化感物質聯(lián)合抑藻的模型建立及數(shù)學最優(yōu)化. 環(huán)境科學學報, 2012, 32(8): 1894-1901.

[10] Liza López M, Bonzani N E, Zygadlo J A. Allelopathic potential of Tagetes minuta terpenes by a chemical, anatomical and phytotoxic approach. Biochemical Systematics and Ecology, 2008, 36(12): 882-890.

[11] Kato-Noguchi H. Rice allelopathy and momilactone. Pakistan Journal of Weed Science Research, 2012, 18(Special): 289-296.

[12] Zhang T T, He M, Nie L W. Allelopathic effects of submerged macrophyteCharavulgarison toxicMicrocystisaeruginosa. Allelopathy Journal, 2009, 23(2): 391-402.

[13] Zhang T T, Hu W, Zhang D. Allelopathic effect ofTyphaangustifoliaL. on phytoplankton. Advanced Materials Research, 2012, 383-390: 3724-3728.

[14] 胡光濟, 張維昊, 尚吟竹, 何流. 菖蒲干體提取液對兩種水華藻類生長的影響. 應用生態(tài)學報, 2009, 20(9): 2277-2282.

[15] Zhang T T, Zheng C Y, Hu W, Xu W W, Wang H F. The allelopathy and allelopathic mechanism of phenolic acids on toxicMicrocystisaeruginosa. Journal of Applied Phycology, 2010, 22(1): 71-77.

[16] Zhang T T, Wang L L, He Z X, Zhang D. Growth inhibition and biochemical changes of cyanobacteria induced by emergent macrophyteThaliadealbataroots. Biochemical Systematics and Ecology, 2011, 39(2): 88-94.

Studies on the inhibition of vetiver oil to freshwater algae

ZHANG Dian, LI Cheng, LIU Lu, ZHANG Shengjuan, ZHANG Tingting*

TheKeyLaboratoryofBioticEnvironmentandEcologicalSafetyinAnhuiProvince,CollegeofLifeSciences,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China

Eutrophication tends to stimulate rapid explosive growth of cyanobacteria, leading to water bloom. Some cyanobacteria can release neurotoxins, hepatoxins, dermatoltoxins, gastrointestinal toxins and cytotoxins, which can be toxic to humans and aquatic animals. How to control the undesired cyanobacteria growth in an aquatic ecosystem? It has been reported that allelopathy and allelochemicals of aquatic macrophytes have certain effects in dealing with this tough issue. It is also reported that vetiver, an emergent plant with flourishing roots, can not only absorb water bodies nitrogen and phosphorus but also secret some allelochemicals to inhibit the growth of cyanobacteria. In the planned experiment on some powerful allelochemicals that can control the growth of cyanobacteria or other floating algae effectively, the inhibitory effects of vetiver oil onMicrocystisaeruginosaandScenedesmusobliquus, when the two algae species were cultured alone or cultured together, were respectively found and discussed for the first time in this study, and the mathematical models were also established about the inhibition of vetiver oil on those two algae species in mixed culture. Moreover, the composition of vetiver oil was assayed and identified by GC-MS. The results showed that vetiver oil had excellent inhibition onM.aeruginosaandS.obliquusin both pure and mixed culture. The EC50of vetiver oil on these two algae species in pure culture were 0.20 and 0.30 mL/L respectively, which indicated that the inhibitory effects of vetiver oil, like most other aquatic macrophyte and allelochemicals, has species specificity, i.e., the inhibition of vetiver oil on cyanobacteria (M.aeruginosa) is much better than that on green algae (S.obliquus). Because cyanobacterial dominance is most pronounced during the summer months, there is the huge potential for vetiver oil to develop an effective biological cyanobacterial inhibiting agent. The allelochemicals in vetiver oil assayed and identified by GC-MS showed that the main chemical components of vetiver oil are sesquiterpenes, including 1-cyclohexyl-butanone, terpineol, cedar alcohol, cuparene, α-chamigrene, δ-cadinene, α-cadinene and -cedrene in addition to some alkanol and ketone, and among them sesquiterpenes have the most powerful allelopathy according to the papers reported by far. The mathematic models of mixed culture established through the analysis of the results of the experiment could provide the species densities ofM.aeruginosaandS.obliquusat any time point as well as that of the concentration of vetiver oil for the best inhibition. Because the mathematic model related to allelopathy studied relatively very limited, the mathematical model undoubtedly has some reference application value for using allelochemicals to inhibit the growth of algae, especially for two algae species in mixed culture. All in all, this research has important theoretical and application value on prevention and control of cyanobacteria blooms, as well as comprehensive utilization of vetiver oil.

vetiver oil;M.aeruginosa;S.obliquus; allelochemicals; mathematical models

國家自然科學基金項目(31170443)

2013-05-21;

日期:2014-04-25

10.5846/stxb201305211135

*通訊作者Corresponding author.E-mail: cyhztt@ mail.ahnu.edu.cn

章典，李誠，劉璐，張勝娟，張庭廷.巖蘭草油對淡水藻類的抑制作用.生態(tài)學報,2015,35(6):1845-1851.

Zhang D, Li C, Liu L, Zhang S J, Zhang T T.Studies on the inhibition of vetiver oil to freshwater algae.Acta Ecologica Sinica,2015,35(6):1845-1851.