馮莉莉，王月華

（山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東 諸城262200）

本試驗通過對新城疫疑似病例的發(fā)生背景及流行病學進行調查，臨床癥狀及病理學變化詳細觀察，并進行病毒的分離、鑒定及序列分析，對本病例做出了確切診斷，并對發(fā)生原因進行了分析，報告如下。

1 發(fā)病情況

2013 年3 月，山東省泰安市某蛋雞養(yǎng)殖場的40日齡育成雞雖經弱毒苗和油乳劑滅活疫苗3 次免疫（分別是7 日齡ⅣH120 新城疫-傳支二聯疫苗1 倍量滴鼻，28 日齡ⅣH120 新城疫-傳支二聯疫苗2 倍量飲水，35 日齡注射新-支-流三聯油苗注射免疫），10 000 只育成雞突然發(fā)生以采食下降、精神沉郁、呼吸困難、排黃綠色便為主要特征的疾病。發(fā)病后第2 天開始死亡，死亡率迅速上升，高峰時每天死亡400 多只，死亡雞只3 000 余只，死亡率超過30%。

2 臨床診斷

本雞群自40 日齡起，部分雞出現精神委靡，病程較長的病雞出現觀星、扭脖、翅下垂、癱瘓等神經癥狀；羽毛蓬松，有明顯呼吸道癥狀，病雞呼嚕、甩鼻、張嘴呼吸；食欲減退，嗉囊積液，排黃綠色稀糞，呈急性病程，高峰期日死亡達400 余只，死亡率超過20%。經調查該場305 日齡的產蛋雞群2 周前曾出現過呼吸道癥狀，拉灰綠色稀糞，采食量下降，產蛋率下降20%左右，死亡30 余只。

3 病理變化

剖檢見腺胃乳頭及腺胃與肌胃交界處出血，十二指腸末端、空腸中部卵黃遺跡后4 cm 處，回腸起始部淋巴濾泡處黏膜腫脹、充血、出血、潰瘍，盲腸扁桃體黏膜腫脹、充血、出血，直腸黏膜點狀出血；氣管黏膜附有黏液，黏膜充血。

4 實驗室檢驗

4.1 病理組織學檢查 腸黏膜上皮細胞壞死、脫落，黏膜固有層淋巴細胞浸潤、充血，黏膜固有層淋巴濾泡處淋巴細胞壞死、崩解，眼觀潰瘍處黏膜發(fā)生出血性壞死，肌層出血，黏膜固有層水腫呈典型漿液性炎癥。非潰瘍處黏膜固有層也見明顯充血、出血，淋巴細胞大量浸潤；脾臟見淋巴細胞灶狀壞死；部分病雞腦膜充血、出血，血管周圍淋巴細胞大量浸潤，呈明顯的血管袖套現象，并見明顯的衛(wèi)星現象、噬神經現象，小膠質細胞結節(jié)狀增生。

4.2 病毒的分離和鑒定

4.2.1 病毒分離 將病料經尿囊腔接種9～12 日齡的雞胚8 枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，，棄去24 h 內死亡胚，無菌收取96 h 內的死胚和活胚尿囊液。第1代8枚中有6枚雞胚在72 h出現死亡，致死率達75%，死亡雞胚胚體出血、水腫。將收獲的尿囊液按常規(guī)方法進行梯度倍比稀釋，測定血凝活性，結果分離病毒對1%雞紅細胞的血凝效價為7Log2。

4.2.2 細胞病變觀察（CEF 細胞接種） 制備雞胚原代細胞。在無菌條件下采取9～11 日齡的雞胚，至滅菌的平皿中，去除頭、爪和內臟，并用眼科剪剪成1 mm3小塊，用PBS 清洗，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，棄去上層洗液，再加洗液，如此反復沖洗3 遍后，棄去上清液。于沉淀組織塊內加入2 mL 的0.25%胰酶，放入到37 ℃溫箱中進行消化，每隔2 min 輕輕搖動1 次。取出后小心吸棄上層胰酶溶液，用PBS 輕洗2 次后加入些許5%生長液，用吸管將細胞團塊吹打開。靜置片刻，將上清液通過4 層紗布過濾。細胞計數，最終將細胞稀釋成5×105個細胞/mL，取8 mL濾液于細胞瓶中。放入到37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分離出的病毒能在CEF 細胞上生長，引起典型的細胞病變。

4.2.3 病毒感染力的滴定（TCID50的測定） 按Reed和Muench 氏法計算：距離比例=（高于50%HA分數-50%）/（高于50%HA 分數-低于50%HA 分數）。

TCID50的對數=高于50%的病毒稀釋度的對數+距離比例×稀釋系數的對數。

距離比例=（100%-50%）/（100%-37.5%）=0.8

本試驗高于50%的病毒稀釋度的對數-4，距離比例為0.8，稀釋系數的對數為-1，LgTCID50=-4+0.8×（-1）=-4.8，即TCID50=10-4.8/0.1 mL，即病毒作10-4.8稀釋，每孔接種0.1 mL 能使半數細胞孔有細胞病變。

4.3 免疫學鑒定

4.3.1 抗體檢測 對發(fā)病雞群先后進行了2 次抗體檢測，第1 次于發(fā)病后第3 天，第2 次于發(fā)病后第15 天。另外，還對該雞場305 日齡的產蛋雞群還進行了抗體檢測，每次檢測20 個樣品。

表1 發(fā)病雞群及產蛋雞群新城疫抗體檢測結果

從表1 可以看出，育成雞雞群發(fā)病剛開始時檢測，新城疫抗體水平很低，平均效價為3.2 個滴度，2 以下的占25%；當發(fā)病后15 d 時檢測抗體水平顯著上升，平均效價達7 個滴度，為發(fā)病初的2.22 倍，7 個滴度以上的占60%，11 個高度以上的達10%，且抗體水平的離散度較大；產蛋雞群抗體水平較高，平均效價為11 個滴度，10 個滴度以上的占80%，其中13個滴度以上的占25%，且抗體水平離散度較大。分析檢測結果可知，育成雞群因感染新城疫病毒，抗體水平迅速升高，出現較大離散度；而產蛋雞群也屬于新城疫感染雞群，據調查發(fā)現本雞群以前確實曾出現過呼吸道癥狀和產蛋下降現象。

4.3.2 血清中和試驗 將分離毒株分別與EDS、ND、QJ（H5）、RE-4（H5）、RE-5（H5）、S2（H9）等6 種標準陽性血清等量混合，然后按照常規(guī)方法進行血凝試驗。只有新城疫陽性血清能夠完全中和分離病毒，而其他5 份陽性血清都不能中和本病毒，可初步判斷為新城疫病毒感染。

4.4 病毒分子生物學鑒定

4.4.1 PCR 測定 根據GenBank 中ND 全基因組序列，設計合成引物。用提取的RNA 進行反轉錄：采用10 μL 反轉錄體系，反應體系及條件如下：70 ℃5 min，然后加入M-MLV，42 ℃30 min，95 ℃2 min。用制備的cDNA 進行PCR：采用50 μL PCR 體系，反應條件如下：經94 ℃5 min 變性，然后94 ℃30 s ，50 ℃30 s，72 ℃40 s，30 個循環(huán)擴增，72 ℃10 min 延伸。反應結束后，取5 μL PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。將PCR 擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結果出現700 bp左右的一條亮帶，與預期的目的片段大小一致。

4.4.2 遺傳進化分析 將鑒定陽性的質粒送到博尚公司測序。并與GenBank中登錄的NDV參考株基因進行序列比對，構建系統(tǒng)進化樹。所用病毒GenBank登錄號為：AY288987.1，AY288989.1，AY288993.1，AY288999.1，EU518677.1，EU518680.1，EU518681.1，EU518682.1，EU518683.1，EU518684.1，JN872181.1，JN942027.1，JN942028.1，JN942031.1，JN942032.1，JN942039.1，JN942040.1，JN967789.1，JQ697743.1，JQ697744.1，JX974435.1 等。本分離毒株與GenBank上登錄的ND 參考毒株的同源性達到90%，說明此次疫情的是由新城疫感染病毒所致。本分離毒株與Newcastle disease virus isolate chicken/MX/NC04-635/2010（JQ697744.1）的同源性達到100%，屬于同一分支。

5 發(fā)病原因分析

我國各類養(yǎng)雞場都非常重視新城疫免疫，當前隨著疫苗的廣泛使用，新城疫在一定程度上得到了控制，免疫雞群常見非典型新城疫發(fā)生，雞群暴發(fā)典型新城疫的情況已比較少見，但該雞群在已進行3 次免疫的情況下還是暴發(fā)了典型新城疫。究其原因，一方面可能源于雞群免疫失敗，另一方面則因在易感期感染了強毒新城疫病毒。發(fā)病3 d 時檢測該雞群新城疫抗體結果表明，免疫水平較低，2 個滴度以下的占25%，該雞群發(fā)病后死亡率也是20%左右，這說明該雞群暴發(fā)典型新城疫的最直接原因是新城疫免疫失敗。

Patti J M 等研究表明，長期的免疫預防能導致NDV 的變異而產生強毒株，變異毒株與疫苗株在生物學特性、血清學和遺傳學上有較大的差異，致使現有的NDV 疫苗免疫后不能形成有效地保護。在免疫選擇壓的作用下NDV 的毒力有增強的趨勢，目前基因Ⅶ型d 亞型超強毒株在我國廣為流行，即使經多次免疫的成年雞群也難以抵擋住強毒新城疫病毒的侵襲，常發(fā)生非典型新城疫。

鑒于以上發(fā)病原因，建議從無免疫抑制病如傳染性腔上囊病、雞貧血、馬立克病、白血病等種雞場引進雞苗；在免疫前后飲用電解多維以減少雞群的應激反應。僅靠疫苗來消除ND強毒感染是不行的，要從根本上控制和消滅ND的發(fā)生,除選擇適合的疫苗和制定合理的免疫程序外，更主要是采取綜合性防疫措施，減少或消滅雞群中的ND 強毒，阻止外界的ND 強毒進入雞群，最終達到控制ND 的目的。