邱 洪，朱兆榮，劉 娟，凌榕鑌，羅藝晨

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

術(shù)苦芩是根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床辨證的原則，選用黃芩、苦參、白術(shù)、金銀花、藿香等多味中藥組成的復(fù)方制劑[1]。臨床試驗(yàn)證明，其能有效改善犬細(xì)小病毒病所致的免疫力下降，對(duì)犬細(xì)小病毒病具有一定預(yù)防和治療作用[2-3]，同時(shí)能對(duì)細(xì)小病毒病犬的各種組織器官起到較好的保護(hù)作用[4-7]。鑒于方中清熱解毒的黃芩，燥濕、利水的苦參，補(bǔ)脾健胃的白術(shù)，均為術(shù)苦芩的君藥；金銀花、白頭翁、黃芪及藿香等具有清熱解毒、止痢，補(bǔ)氣升陽、利水消腫，芳香化濕、行氣和中等功效，共為臣、佐藥。此方諸藥合用，可清熱燥濕，利水止痢，治濕熱泄瀉之癥等[8]。術(shù)苦芩顆粒劑主要含有黃芩苷、苦參堿，而其活性成分具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗心律失常、降壓、抗腫瘤、抗過敏、抗病毒及解熱鎮(zhèn)痛等作用[9-11]，因此選定黃芩苷和苦參堿作為日后工業(yè)化生產(chǎn)術(shù)苦芩顆粒提供有效質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。本試驗(yàn)建立了術(shù)苦芩顆粒劑HPLC色譜法測定其中主要有效成分黃芩苷和苦參堿的含量方法，為其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試藥與試劑 術(shù)苦芩顆粒（1 g生藥/g，西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系獸醫(yī)科學(xué)研究中心中藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室研究，重慶市天龍牧業(yè)科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20110820，20110829，20110910）；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110423）；苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110805-200508）；乙腈（Honeywell Burdick＆Jackson Ulsan，批號(hào)：N6QA1H，色譜級(jí)）；甲醇（SKChemicals，批號(hào)：AH230-4，色譜級(jí)）；磷酸（川東化工有限公司，批號(hào)：20121001，分析級(jí)）；三乙胺（上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司，批號(hào)：20131211，分析級(jí)）。

1.2 主要儀器設(shè)備 SPD-20A紫外檢測器（日本島津公司）；DGU-20A3脫氣機(jī)（日本島津公司）；LC-20AD型泵（日本島津公司）；CTO-20A柱溫箱（日本島津公司）；AB135-S電子分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）；純水儀；SB-25-12型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；C18柱4.6mm×250mm，5μm（島津公司）；4.6mm×150mm，5μm，WelchWaterials公司。

1.3 試藥準(zhǔn)備與檢測方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備 分別取黃芩苷對(duì)照品和苦參堿對(duì)照品適量，精密稱定，加各自的流動(dòng)相制成每毫升含黃芩苷60μg的溶液和每毫升含苦參堿50μg的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液制備 取術(shù)苦芩顆粒適量，研細(xì)，過七號(hào)篩。黃芩苷供試品：取0.5 g細(xì)粉于具塞錐形瓶中，精密加入100mL甲醇，密塞，稱重，超聲（250 W，35 kHz）30min，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過，精密量取濾液10mL至100mL容量瓶中，即得?？鄥A供試品：取3 g細(xì)粉于具塞錐形瓶中，精密加入28.8mL氯仿和1.2mL氨水，密塞，稱重，在超聲（250W，35kHz）20min，稱重，用三氯甲烷補(bǔ)足減失重量，濾過，精密量取濾液10mL至蒸發(fā)皿，水浴蒸干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容即得。

1.3.3 色譜條件 均以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：30℃；進(jìn)樣10μL；流速：1mL/min。黃芩苷色譜條件以甲醇-0.4%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0）（52∶48）為流動(dòng)相，檢測波長為274 nm。

苦參堿色譜條件以乙腈-甲醇-0.2%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.0）（22∶13∶65）為流動(dòng)相，檢測波長為220 nm。

1.3.4 線性關(guān)系 取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液 200μg/mL，用流動(dòng)相依次稀釋為150μg/mL、100μg/mL、50 μg/mL、25μg/mL、10μg/mL。取苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液400μg/mL，用流動(dòng)相依次稀釋為200μg/mL、150 μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL。按1.3.3色譜條件方法分別進(jìn)行測定，進(jìn)樣10μL，測定結(jié)果以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.5 專屬性 分別取等份的不含黃芩的術(shù)苦芩顆粒、不含苦參的術(shù)苦芩顆粒和術(shù)苦芩顆粒適量，按1.3.2方法配置陰性對(duì)照供試品溶液和供試品溶液。用1.3.3色譜條件進(jìn)行測定，考察此方法的專屬性。

1.3.6 精密性和重復(fù)性 用1.3.2方法制備供試品溶液，用1.3.3色譜條件測定，平行測定6次，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，來考察儀器精密性。精密稱取同一批術(shù)苦芩顆粒6份，按1.3.2方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄黃芩苷峰面積和苦參堿峰面積，計(jì)算結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，來考察樣品測定的重復(fù)性。

1.3.7 加樣回收率 精密量取術(shù)苦芩顆粒1.25 g于錐形瓶中，電子天平精密加入黃芩苷對(duì)照品10.0mg。精密量取術(shù)苦芩顆粒3.0 g于錐形瓶中，電子天平精密加入苦參堿對(duì)照品1.8 mg。按照

1.3.2 方法和1.3.3色譜條件分別進(jìn)行處理和測定，計(jì)算加樣回收率，重復(fù)6次。

1.3.8 定量限 分別準(zhǔn)確稱取5份不含苦參的術(shù)苦芩顆粒，按1.3.2樣品處理方法進(jìn)行處理，測得基線噪音平均值。用流動(dòng)相稀釋供試品溶液成不同濃度的供試液，依1.3.3色譜條件進(jìn)行測定，以響應(yīng)信號(hào)和噪音之比（S/N）為10的最低稀釋濃度作為定量限。

1.3.9 耐用性 在原方法基礎(chǔ)上，分別改變?nèi)缦聴l件。黃芩苷耐用性考察：樣品處理時(shí)間（20min、30 min、40min）、流動(dòng)相配比（50∶50、52∶48、54∶46）、pH值（2.8、3.0、3.5）、溫度（25℃、30℃、35℃），以及色譜柱規(guī)格（4.6μm×150mm、4.6μm×250mm）?？鄥A耐用性考察：樣品處理時(shí)間（10min、20min、30 min）、流動(dòng)相配比（25∶15∶60、22∶13∶65、18∶12∶70）、pH值（6.5、7.0、7.5）、溫度（25℃、30℃、35℃），以及色譜柱規(guī)格（4.6μm×150mm、4.6μm×250mm），再對(duì)測定結(jié)果的色譜圖的分離度，拖尾因子進(jìn)行評(píng)測，考察該色譜方法的耐用性。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 用建立的含量測定方法分別測定系列黃芩苷對(duì)照品溶液和苦參堿對(duì)照品溶液，其濃度與峰面積的線性回歸方程分別為Y=5.56763×10-8X-2.79465×10-3（r=0.99991）和Y=3.4334×104X-2.0406×103（r=0.99994），說明在黃芩苷和苦參堿分別在濃度為10μg/mL～150μg/mL和10μg/mL～400μg/mL范圍內(nèi)與峰面積均呈良好線性關(guān)系。

2.2 專屬性 測定結(jié)果色譜圖見圖1，在黃芩苷對(duì)照品和苦參堿對(duì)照品峰的保留時(shí)間上供試品顯示，按供試品配置方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h，進(jìn)行測定得出術(shù)苦芩中黃芩苷和苦參堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.096%和0.280%。精密試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)同一供試品溶液平行測定6次，測得黃芩苷和苦參堿的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.023%和0.653%，精密性符合2010年版獸藥典含量測定方法RSD＜2.0%的規(guī)定，此法的精度性符合含量測定的要求。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，計(jì)算黃芩苷均有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，陰性對(duì)照無對(duì)應(yīng)色譜峰，表明用此法在測定術(shù)苦芩顆粒中黃芩苷含量和苦參堿含量時(shí)均具有較好的專屬性。

2.3 穩(wěn)定性、精密性和重復(fù)性 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果和苦參堿峰面積的RSD分別為0.228%和0.997%，表明重復(fù)性良好。

2.4 加樣回收率 分別精密稱取6份術(shù)苦芩顆粒3.0 g于錐形瓶，精密加入黃芩苷對(duì)照品10.0mg和苦參堿對(duì)照品1.8mg，其他按照1.2.3方法制備，分別測定。測得結(jié)果為術(shù)苦芩中黃芩苷和苦參堿的平均回收率分別為99.22%（RSD為0.641%）和98.33%（RSD為1.257%），結(jié)果見表1。

2.5 定量限 根據(jù)5個(gè)陰性對(duì)照的基線噪音平均值分別為噪音值N1（黃芩苷）和N2（苦參堿），術(shù)苦芩顆粒供試品檢測黃芩苷峰信號(hào)和苦參堿峰信號(hào)為信號(hào)值（S1和S2），以S/N≥10作為定量標(biāo)準(zhǔn)，測得此法測定術(shù)苦芩顆粒中黃芩苷含量和苦參堿含量的定量限分別為2μg/mL和4μg/mL。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測定 取不同批的術(shù)苦芩顆粒樣品6份，精密稱定，按1.3.2方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL，記錄色譜峰，計(jì)算苦參堿的含量，結(jié)果見表2。

表2 術(shù)苦芩顆粒中黃芩苷和苦參堿的含量 （n=6）

2.7 耐用性 試驗(yàn)通過改變樣品處理時(shí)間、色譜條件中流動(dòng)相的配比、流動(dòng)相的pH值、柱溫、色譜柱類型以考察此法的耐用性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在條件改變的情況下，樣品中黃芩苷波峰和苦參堿波峰的分離度均＞2、拖尾因子均介于0.95～1.05之間、理論塔板數(shù)均在10 000以上。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察 采用超聲法處理供試樣品，其超聲震蕩作用均加大了黃芩苷和苦參堿的溶出度及溶出速度[13]；同時(shí)，利用三氯甲烷增加苦參堿溶出率[14-17]。在超聲提取方法中，考察了超聲不同時(shí)間（黃芩苷：20min、30min、40min，苦參堿：10min、20min、30min）的提取效果，結(jié)果表明，在分別超聲30min后和20min后提取的黃芩苷和苦參堿經(jīng)測定均無顯著變化，因此提取黃芩苷和苦參堿分別選取超聲30min和20min。

3.2 檢測波長的選擇 取黃芩苷對(duì)照溶液和苦參對(duì)照品溶液作紫外光譜掃描，結(jié)果可見黃芩苷在274 nm和苦參堿在220.1 nm波長處有最大吸收，且在分別在（273.2±3）nm和（219.2±2）nm波長范圍內(nèi)吸收穩(wěn)定，基線較好，對(duì)測定無干擾。因此，參考2010年版《中國藥典》（一部）中關(guān)于黃芩藥材中黃芩苷和苦參藥材中苦參堿的檢測標(biāo)準(zhǔn)中的最大吸收波長，并結(jié)合本研究，最終選用274 nm和238 nm作為本試驗(yàn)的檢測波長。

3.3流動(dòng)相的選擇 C18為填充物的反向色譜柱作為分析柱，黃芩苷的流動(dòng)相有機(jī)相組分為甲醇，無機(jī)相選擇0.4%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0）?？鄥A的流動(dòng)相有機(jī)相組分為乙腈和甲醇，無機(jī)相選擇0.2%磷酸溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至7.0）。黃芩苷的峰形和苦參堿的峰形均較好，且與相鄰雜質(zhì)峰都能達(dá)到較好的分離，保留時(shí)間適中。

3.4 本試驗(yàn)建立了術(shù)苦芩顆粒中黃芩苷和苦參堿含量高效液相色譜檢測方法 分別以甲醇和三氯甲烷作為溶劑用超聲法對(duì)顆粒劑進(jìn)行處理，C18色譜柱作為分析柱，紫外檢測器檢測。所建立的方法的專屬性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、檢測靈敏度及方法的耐用性能滿足術(shù)苦芩顆粒中黃芩苷含量和苦參堿含量測定的要求。

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