郝一妹，張煥容，2

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610041；2.動物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實驗室，四川 成都610041）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起犢牛腹瀉的重要病原菌。ETEC的致病過程是細(xì)菌依賴黏附素，在腸道內(nèi)定居、繁殖，然后釋放細(xì)菌毒素引起細(xì)胞壞死和腸道紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致急性腹瀉[1]。黏附素、腸毒素、溶血素等是與其致病過程有關(guān)的致病因子[2]，某些血清型也與大腸桿菌的致病性有關(guān)。國外有關(guān)于大腸桿菌的O抗原血清型與腸毒素和黏附素類型之間關(guān)系的相關(guān)研究報道。本研究檢測了分離自牦牛腹瀉樣品中的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的血清型和毒力基因攜帶情況，為牦牛源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌病的預(yù)防和治療提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 分離自川西北甘孜州和阿壩州腹瀉牦牛糞便棉拭子的41株產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌，及參 考 菌 株SWUN4598（HlyA、HlyE）、SWUN4608（HlyE、ehxA）由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室保存；參 考 菌 株CVCC215（K99、STa、F4）、CVCC208（STa、987P）、CVCC196（K88、astA），購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2 引物的合成 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]和GenBank上已公布的序列，設(shè)計了10種毒力基因引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 血清型鑒定 參考O抗原血清分型鑒定方法，鑒定41株牦牛源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的血清型。

1.4 毒力基因PCR檢測 參照文獻(xiàn)中PCR反應(yīng)條件，優(yōu)化后對41株牦牛源ETEC的10種毒力基因進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 血清型鑒定 玻片凝集試驗顯示41株分離細(xì)菌中，有20種不同的血清型，分別為：O1，O4，O7，O15，O22，O26，O27，O28，O34，O36，O54，O56，O57，O74，O87，O96，O110，O133和O149，其中O1和O15為主要流行的血清型，均占定型菌株的20%（8/40）。定型菌株存在一定比例的常見致病性血清型：O1（8），O15（8），O22（1），O26（1）和O36（1），常見致病性菌株比例為47.5%（19/40）。有1株未能確定血清型。

2.2 毒力基因的分布 41株牦牛源ETEC菌株均含有K99基因，攜帶astA，ehxA，HlyA，HlyE，STa基因的菌株數(shù)分別為25，23，15，5，4。LT、K88、987P和F41在這41株菌中均未檢測到。13株細(xì)菌擁有3個毒力基因，K99+astA+ehxA、K99+astA+HlyA和K99+HlyA+ehxA、K99+ehxA+STa分別有5、4、3株和1株。11株細(xì)菌有4個毒力基因，其中K99+astA+ehxA+HlyA有8株，K99+astA+HlyA+HlyE有2株，K99+ehxA+HlyA+HlyE有1株。有2株細(xì)菌有5個毒力基因，分別為K99+astA+ehxA+HlyA+HlyE和K99+astA+ehxA+HlyA+STa。

3 討論

本試驗對分離自四川甘孜州和阿壩州兩藏區(qū)牦牛腹瀉樣品中的ETEC采用O抗原血清型鑒定，結(jié)果表明，樣品中的ETEC存在多種血清型，O1和O15為主要流行的血清型。本試驗結(jié)果與文獻(xiàn)報道的牛源ETEC的流行血清型存在一定的相似性，也具有一定的差異性。

黏附素、腸毒素、溶血素是ETEC致病因子[3]。黏附素主要由K99、K88、987P、F41等菌毛基因編碼，其中K99的分布最為廣泛，且為牛、羊、豬等牲畜所共有[4]。本試驗中，41株ETEC中均攜帶有K99菌毛基因，未檢測到其他3種菌毛基因。溶血素基因雖為腸出血性大腸桿菌（EHEC）的靶基因之一[5]，但也存在于ETEC菌株[6]，Smith在1967年報道大腸桿菌的溶血性可遺傳轉(zhuǎn)移，試驗結(jié)果顯示，溶血性大腸桿菌的靶基因HlyA在本次鑒定的牦牛源ETEC中的攜帶率高達(dá)37%（15/41），與相關(guān)報道一致。astA基因主要分布在腸致病性大腸桿菌中[7]，在產(chǎn)志賀菌毒素大腸桿菌中有檢出[8]，但在本試驗的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌中也有檢出，且檢出比例高。本試驗對牦牛腹瀉樣品中分離的ETEC的血清型和毒力基因的研究豐富了大腸桿菌的毒力基因研究的相關(guān)資料，為進(jìn)一步研究牦牛源ETEC的致病機(jī)理和防治措施提供了一定的理論依據(jù)。

[1]Nataro JP，Kaper JB.Diarrheagenic Escherichia coli[J].Clin Microbiol Rev，1988，11（1）：142-201.

[2]Patel SK，Dotson J，Allen K P，et al.Identification and molecular characterization of EatA，an autotransporter protein of enterotoxigenic Escherichia coli[J].Infect Immun，2004，72（3）：1786-1794．

[3] Nagy B，F(xiàn)ekete P Z.Enterotoxigenic Escherichia coli（ETEC）in farm animals[J].Vet Res，1999，30（2-3）：259-284.

[4]高研，李衛(wèi)芬，馬國霞.產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌主要致病因子及其致病機(jī)理的研究進(jìn)展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2006，5：2-5.

[5]安微，張秀英，李蕊，等.致病性大腸桿菌毒力因子和耐藥性研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫(yī)學(xué)報，2013，45（8）：106-109.

[6] Miyuki Fujika，kosuke kasai，Tomisato miura，et al.Rapid Diagnostic Method for the detection of Diarrheagenic Escherichia coli by Multiplex PCR[J].Jpn JInfect Dis，2009，62：476-480.

[7]Franck SM，Bosworth B T，Moon HW.Multiplex PCR for enterotoxigenic，attaching and effacing and Shiga toxinproducing Escherichia colistrains fromcalves[J].JClin Microbiology，1998，36（6）：1795-1797.

[8]Pass M A，odedra R，Batt R M.Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence gene[J].JClin Microbiology，2000，38（5）：2001-2004.