安彩霞，趙亞楠，李婷婷，王紅娟，普雄明

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830001）

臨床研究表明, 窄譜中波紫外線（Narrow band ultraviolet B，NB-UVB）對于白癜風(fēng)患者具有較好的臨床療效[1]。但其作用機制目前尚不完全清楚[2-3]，我們采用體外培養(yǎng)人的黑素細(xì)胞作為研究對象，對其進行NB-UVB 的照射，觀察照射前后黑素細(xì)胞增殖和黑素合成功能的變化，以此探討窄譜中波紫外線治療白癜風(fēng)的可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 氨甲環(huán)酸粉劑：中國食品藥品檢定研究院；胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin）：美國Gibco 公司；培養(yǎng)基（M1，M2）、CCK－8 試劑、TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）、L－D0PA（左旋多巴）：美國Sigma 公司；NB－UVB 紫外線治療儀（9W）：飛利浦公司；倒置相差顯微鏡：日本Nikon；二氧化碳培養(yǎng)箱：上海力申科學(xué)儀器有限公司；全自動酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad 公司；

1.2 研究方法

1.2.1 正常人黑素細(xì)胞的培養(yǎng) 取正常人包皮皮膚，剪成碎塊后以0.25%胰蛋白酶冷消化12～15 h，胎牛血清終止消化，離心并收集細(xì)胞，M1 培養(yǎng)基培養(yǎng)原代，待出現(xiàn)大量典型梭形黑素細(xì)胞后（約10 d），再行胰酶消化，離心收集黑素細(xì)胞，置于M2 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至3～4 代，選擇對數(shù)生長期的黑素細(xì)胞進行實驗。

1.2.2 黑素細(xì)胞增殖的測定 將傳代細(xì)胞的濃度調(diào)整至5×104個/孔后加入96 孔培養(yǎng)板。24 h 細(xì)胞貼壁后用不同劑量的NB-UVB 照射（照射劑量根據(jù)照射時間分為0，20，40，60，80，100 s），設(shè)立非照射陰性對照組，每一處理因素設(shè)立4 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于結(jié)束前4 h，加入CCK-8 液50 μL/孔，置酶標(biāo)儀490 nm 波長測吸收光光度值，細(xì)胞增殖率=（待篩物各濃度平均吸光度值-空白組平均吸光度值）/（對照組平均吸光度值-空白組平均吸光度值）×100%。

1.2.3 酪氨酸酶活性的測定 96 孔培養(yǎng)板加入細(xì)胞濃度為5×104個/孔的黑素細(xì)胞懸液，24 h 后用不同劑量的NB-UVB 照射，并設(shè)立對照組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h 后棄去上清液，PBS 洗2 次，每孔加0.1%的TritonX-100 溶液100 μL，振蕩15 min，使細(xì)胞完全破裂，加入0.1%L-DOPA 溶液50 μL/孔，37 ℃反應(yīng)過夜，于酶標(biāo)儀490 nm 波長處行吸收光光度值測定，酪氨酸酶活性=酶標(biāo)儀所測吸光度值/細(xì)胞增殖的吸光度值。

1.2.4 黑素含量的測定 6 孔培養(yǎng)板加入細(xì)胞濃度為2.5×105個/孔的黑素細(xì)胞懸液，24 h 后用不同劑量的NB-UVB 照射，并設(shè)立非照射陰性對照組繼續(xù)培養(yǎng)72 h。72 h 后棄上清液，PBS 液沖洗，消化、離心并收集細(xì)胞，血細(xì)胞計數(shù)器進行細(xì)胞計數(shù)；然后PBS洗滌2 次，重新溶解于1 mol/L NaOH 500 μL；80 ℃水浴2 h，轉(zhuǎn)移至96 孔板，設(shè)4 個復(fù)孔，每孔100 μL；置酶標(biāo)儀于405 nm 波長測吸光度值，黑素合成量=各孔吸光度值/各孔細(xì)胞密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件分析，對實驗結(jié)果進行單因素方差分析，P<0.05 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞 黑素細(xì)胞具有特殊的樹突狀結(jié)構(gòu)，體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞多有2 個樹突，呈梭形，見圖1，胞體內(nèi)可見黑素顆粒，實驗前經(jīng)多巴染色陽性，見圖2，證實為黑素細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)NB-UVB 照射后的黑素細(xì)胞胞體變腫脹，樹突變短，細(xì)胞數(shù)目較未照射組明顯減少。

圖1 體外培養(yǎng)正常的黑素細(xì)胞（鏡下×40）

圖2 多巴染色的黑素細(xì)胞（鏡下×40）

2.2 NB-UVB 照射對黑素細(xì)胞增殖的影響 NBUVB 照射對于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用，小劑量20 s 照射其抑制作用與對照比較無統(tǒng)計學(xué)意義，40 s 以上照射對黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用且隨著劑量增大抑制作用增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，見表1，經(jīng)直線相關(guān)分析顯示，NB-UVB 照射劑量與黑素細(xì)胞的增殖具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.784（P<0.05）。

表1 不同劑量NB-UVB 對黑素細(xì)胞增殖的影響

2.3 不同劑量NB-UVB 照射對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響 與對照組比較，NB-UVB 照射對于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性具有促進作用，見表2，當(dāng)NB-UVB 增加到一定劑量后酪氨酸酶活性穩(wěn)定在一定范圍。

表2 不同劑量的NB-UVB 對黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

2.4 不同劑量NB-UVB 照射對正常人黑素細(xì)胞的黑素合成的影響 與對照組比較，只有40 s 劑量NB-UVB 照射對于體外培養(yǎng)的正常人黑素細(xì)胞黑素的合成具有促進作用，20 s 及60 s、100 s 均無明顯作用，而80 s 則具有一定促進作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 不同劑量NB-UVB 照射對正常人黑素細(xì)胞的黑素合成的影響

3 討論

中波紫外線（UVB），波長為290～320 nm，是紫外線生物學(xué)活性中最活躍的部分，對于人體皮膚影響較大。窄譜中波紫外線是指波長在310 nm 左右的中波紫外線，由于其單一性強，能夠透過真皮并能在不導(dǎo)致皮膚灼傷的情況下釋放出更多的能量，因此得以廣泛應(yīng)用于皮膚病的治療。臨床研究證實窄譜中波紫外線對于白癜風(fēng)患者的治療療效較好，可以有效促進色素生成[4-5]，但對于其作用機制尚不明確。從本實驗結(jié)果可以看到，窄譜中波紫外線照射對于人培養(yǎng)純黑素細(xì)胞增殖具有抑制作用，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)，而且其抑制率與紫外線的劑量呈正相關(guān)，這或許提示NB-UVB 治療白癜風(fēng)的作用機制或與其他因素有關(guān)。我們分析這種對體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞增殖的抑制作用符合紫外線的特性，即NB-UVB 對黑素細(xì)胞產(chǎn)生了劑量依賴性殺傷效應(yīng)，隨著照射劑量的提高，細(xì)胞凋亡數(shù)量也逐漸增加[6]。目前較多的研究認(rèn)為，若在體外以UVB 照射純培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，其數(shù)量將會減少[7-8]，僅有少數(shù)研究報道在黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共同培養(yǎng)的條件下經(jīng)過UVB 照射后黑素細(xì)胞數(shù)量會增加[9]，這種結(jié)果的出現(xiàn)或與角質(zhì)細(xì)胞的參與有關(guān)。

紫外線對于黑素細(xì)胞功能的影響，即對酪氨酸酶活性的影響和對黑素合成的影響目前報道也不盡相同[10-11]。Romero-Graille 等[12]報道，以7.2 mJ/cm2的UVB 照射體外與角質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的黑素細(xì)胞，可引起黑素細(xì)胞內(nèi)黑素含量的上升，而其他劑量的UVB 未見對黑素合成有明顯影響；Abdel-Naser[13]的實驗也表明UVB 對體外純的黑素細(xì)胞僅在小劑量時有促進黑素合成的作用，而隨著輻射劑量的增加，對黑素合成未見明顯影響，這與我們的實驗結(jié)果很接近，我們也發(fā)現(xiàn)僅在40 s 劑量時對黑素合成有促進作用，這或許與紫外線照射能促進酪氨酸酶活性增加，而隨著劑量增大，黑素細(xì)胞增殖又受到抑制有關(guān)，具體機制尚需進一步研究。而多項研究報道UVB 照射能促進黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性增加[14-15]。在本實驗結(jié)果中，可以觀察到不同劑量的窄譜中波紫外線對于黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性有不同程度的促進作用。這種促進作用并不隨著劑量逐漸增加，當(dāng)NB-UVB 增加到一定劑量后酪氨酸酶活性穩(wěn)定在一定范圍，這與之前的研究結(jié)果大致相符。曾有實驗發(fā)現(xiàn)UVB 誘導(dǎo)產(chǎn)生的黑素細(xì)胞DNA 損傷片段可以激活酪氨酸酶的活性，從而促進黑素合成[16]，同時發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞膜上具有紫外線（UV）受體，UV 是通過黑素細(xì)胞膜上的光受體激活第二信使系統(tǒng)中的磷脂酶C 和蛋白激酶C，最終出現(xiàn)ɑ-黑素細(xì)胞刺激素樣（ɑ-melanocyte stimulating hormone，ɑ-MCH)作用[17]。由此可以解釋在黑素細(xì)胞受到NB-UVB 照射，黑素細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制而同時會出現(xiàn)酪氨酸酶活性增強的現(xiàn)象，但這種細(xì)胞功能增強并不是隨著照射劑量增加無限增強的，這也體現(xiàn)了紫外線對于黑素細(xì)胞生物學(xué)特性影響的復(fù)雜性，而在人體內(nèi)，這一過程可能會有更多細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)因素的參與，因此，尚需進一步實驗去研究和探討窄譜中波紫外線治療白癜風(fēng)的可能機制。

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