任潔如，馬運(yùn)芳，王建華#a，陳 跡#b（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054；.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054）

阿苯達(dá)唑（Albendazole）是一種廣譜抗寄生蟲藥，被世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦為抗包蟲病的主要藥物之一，近年來(lái)越來(lái)越多地使用于臨床，其療效得到了較為廣泛的認(rèn)可[1]。但是阿苯達(dá)唑的水溶性差，腸道吸收率、體內(nèi)血藥濃度、生物利用度均較低，因此嚴(yán)重制約了阿苯達(dá)唑的推廣應(yīng)用[2]。本課題組前期通過液相沉淀法制備了阿苯達(dá)唑納米混懸液，但納米混懸液長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性不佳，即藥物長(zhǎng)期在液體環(huán)境中可發(fā)生沉降、聚集、降解、變性等各種不穩(wěn)定現(xiàn)象。為提高其貯存穩(wěn)定性，筆者采用冷凍干燥技術(shù)對(duì)納米混懸液進(jìn)行干燥制得阿苯達(dá)唑納米微粉，顯著提高了其常溫放置穩(wěn)定性。但在凍干過程中，預(yù)凍溫度、凍干保護(hù)劑的種類與質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)對(duì)其穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。為此，本研究主要以阿苯達(dá)唑納米微粉的粒徑、Zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)上述因素進(jìn)行考察，旨在確定最佳凍干工藝。

1 材料

1.1 儀器

LG10-2.4A 高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；TGL-16B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；JY92-ⅡDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科技股份有限公司）；ZEN3690 激光粒度分布儀（英國(guó)Malvern公司）；FD5-6P冷凍干燥機(jī)（美國(guó)SIM公司）。

1.2 藥品與試劑

阿苯達(dá)唑原料藥（廣西桂林南藥股份有限公司，批號(hào)：M-D60605，純度：＞99%）；冰醋酸（臺(tái)山市新寧制藥有限公司，批號(hào)：20120209）；聚丙烯酸鈉（美國(guó)Sigma-Aidrich公司，批號(hào)：20060810）；泊洛沙姆188（P188，南京威爾化工公司，批號(hào)：20060401）；聚山梨酯80（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20090207）；葡萄糖（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100407）；麥芽糖（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20120812）；蔗糖、乳糖（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號(hào)：20031022、20030612）；海藻糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20061214）；甘露醇（天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20000318）；木糖醇、山梨醇（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20090318、20090605）；甘氨酸（美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：20101206458），以上試藥均為分析純；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 阿苯達(dá)唑納米混懸液的制備[3]

采用液相沉淀法，稱取處方量的阿苯達(dá)唑原料藥粉，用冰醋酸將其完全溶解，制得阿苯達(dá)唑的冰醋酸溶液。同時(shí)制備含有聚丙烯酸鈉和P188的混合溶液，在超聲和攪拌的條件下，將此混合溶液快速加入阿苯達(dá)唑的冰醋酸溶液中，得到阿苯達(dá)唑納米混懸液。

2.2 凍干工藝制備阿苯達(dá)唑納米微粉

將“2.1”項(xiàng)下制得的阿苯達(dá)唑納米混懸液，在離心半徑5 cm（下同）、10 000 r/min的條件下離心，取出離心產(chǎn)品，加入凍干保護(hù)劑，于低溫冰箱中預(yù)凍后冷凍干燥；待其完全干燥后得阿苯達(dá)唑納米微粉，置于干燥器中避光保存。

2.3 粒徑與Zeta電位的測(cè)定

精密稱取阿苯達(dá)唑納米微粉2 mg 于10 ml 量瓶中，加入10 μl 的10%聚山梨酯80 溶液復(fù)溶，超聲5 min 后用蒸餾水定容至刻度，續(xù)超聲30 min。取5 ml 分散溶液于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上強(qiáng)超聲5 min，采用ZEN3690激光粒度分布儀測(cè)定強(qiáng)超聲后阿苯達(dá)唑納米微粉的粒徑和Zeta電位。

測(cè)定復(fù)溶后的阿苯達(dá)唑納米微粉粒徑，粒徑較小者為佳。帶負(fù)電荷的微粒易被肝細(xì)胞攝取。通常Zeta電位絕對(duì)值越高，其粒子間的靜電斥力越大，體系越不容易發(fā)生聚集，物理穩(wěn)定性越好，越易被肝細(xì)胞攝取而靶向于肝部。Zeta電位絕對(duì)值超過30 mV 被認(rèn)為是靜電穩(wěn)定的納米混懸液，但過大會(huì)有細(xì)胞毒性[4-6]。

2.4 外觀評(píng)價(jià)

觀察阿苯達(dá)唑納米微粉的外觀，以表面松散多孔、色澤一致為佳。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 凍干工藝優(yōu)化

2.6.1 預(yù)凍溫度 為防止真空升華時(shí)產(chǎn)生噴瓶或鼓泡等現(xiàn)象，預(yù)凍溫度必須過冷。文獻(xiàn)[7]報(bào)道至少要確保在體系共熔點(diǎn)溫度以下，產(chǎn)品才能完全凍結(jié)實(shí)。故本試驗(yàn)分別考察－20、－35、－80 ℃下預(yù)凍12 h，解析干燥和升華干燥條件相同，不同預(yù)凍溫度對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同預(yù)凍溫度對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 1 Effects of different pre-freezing temperatures on albendazole nanometer powder（，n＝3）

表1 不同預(yù)凍溫度對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 1 Effects of different pre-freezing temperatures on albendazole nanometer powder（，n＝3）

由表1 可知，在－20、－35、－80 ℃預(yù)凍制得的樣品各評(píng)價(jià)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均能得到較好預(yù)凍效果。從節(jié)能的角度考慮，選擇預(yù)凍溫度為－20 ℃。

2.6.2 單一凍干保護(hù)劑 精密稱取10份阿苯達(dá)唑混懸液離心后的沉淀，于沉淀中分別加入9種常用的凍干保護(hù)劑（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘氨酸），固定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，另取1份為不加凍干保護(hù)劑的空白對(duì)照，解析干燥和升華干燥條件相同，以粒徑、Zeta電位、外觀為指標(biāo)，考察不同種類凍干保護(hù)劑對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響，結(jié)果見表2（“+++”表示表面松散多孔，為均勻乳白色且色澤均一；“++”表示表面松散多孔，色澤不均一，乳白色表面有少量黃色斑塊；“+”表示表面較松散，色澤不一，乳白色表面有大量黃色斑塊）。

表2 不同凍干保護(hù)劑對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of different cryoprotectants on albendazole nanometer powder（，n＝3）

表2 不同凍干保護(hù)劑對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 2 Effects of different cryoprotectants on albendazole nanometer powder（，n＝3）

由表2 可知，凍干保護(hù)劑對(duì)凍干產(chǎn)品均有較好的保護(hù)作用，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別加入葡萄糖和甘露醇后的凍干品粒徑較小且Zeta電位絕對(duì)值較高。甘露醇作為單一凍干保護(hù)劑，可以使凍干產(chǎn)品獲得較好的外觀，表面松散多孔。加入葡萄糖凍干后的產(chǎn)品卻不具備良好的外觀，表面有少量黃色斑塊。而且一般不單獨(dú)使用單糖作為凍干保護(hù)劑，將其與其他凍干保護(hù)劑聯(lián)用效果更好。因此，筆者考慮將葡萄糖和甘露醇聯(lián)用并考察兩者的配比，以期實(shí)現(xiàn)滿意的凍干效果。

2.6.3 兩種凍干保護(hù)劑的配比 精密稱取阿苯達(dá)唑納米混懸液離心后的沉淀，固定凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，預(yù)凍溫度為－20 ℃，解析干燥和升華干燥條件相同，以粒徑和Zeta電位為指標(biāo)，分別考察葡萄糖-甘露醇按不同配比（1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2、9 ∶1）組合后對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響，結(jié)果見表3。

表3 葡萄糖與甘露醇不同配比對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 3 Effects of different ratios of glucose to mannitol on albendazole nanometer powder（，n＝3）

表3 葡萄糖與甘露醇不同配比對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 3 Effects of different ratios of glucose to mannitol on albendazole nanometer powder（，n＝3）

由表3 可知，葡萄糖-甘露醇配比為3 ∶7 時(shí)所制凍干產(chǎn)品的粒徑最小。因此，最后確定以葡萄糖-甘露醇配比為3 ∶7 作為凍干保護(hù)劑的最佳配比。

2.6.4 凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù) 精密稱取阿苯達(dá)唑納米混懸液離心后的沉淀，以葡萄糖-甘露醇（3 ∶7）為凍干保護(hù)劑，預(yù)凍溫度為－20 ℃，解析干燥和升華干燥條件相同，分別考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、2%、4%、8%、12%、16%）凍干保護(hù)劑對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉凍干的影響，結(jié)果見表4。

表4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)凍干保護(hù)劑對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 4 Effects of different mass concentrations of cryoprotectants on albendazole nanometer powder（，n＝3）

表4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)凍干保護(hù)劑對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的影響（，n＝3）Tab 4 Effects of different mass concentrations of cryoprotectants on albendazole nanometer powder（，n＝3）

由表4可知，當(dāng)凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，凍干產(chǎn)品粒徑、Zeta電位為最佳，復(fù)溶性較好，因此確定凍干保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

最終篩選出最佳凍干處方：預(yù)凍溫度為－20 ℃，凍干保護(hù)劑為葡萄糖-甘露醇（3 ∶7），其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。取阿苯達(dá)唑納米混懸液，按最佳處方平行凍干5 份阿苯達(dá)唑納米微粉，測(cè)定其粒徑、Zeta電位。結(jié)果，所制阿苯達(dá)唑納米微粉的粒徑均較小，平均粒徑為（208.03±2.13）nm，RSD 為1.02%（n＝5）；平均Zeta電位為（－15.53±0.18）mV，RSD為1.13%（n＝5）。

3 討論

冷凍干燥，是指先將濕物料的水分在低溫下凍結(jié)成固態(tài)的冰，然后在真空條件下，使冰升華為水蒸氣，再用真空系統(tǒng)的捕水器將水蒸氣冷凝，從而獲得干燥制品的技術(shù)[8]。具體分為3 個(gè)過程：預(yù)凍、升華干燥和解析干燥[9]。因?yàn)閮x器設(shè)備原因，本實(shí)驗(yàn)尚不能調(diào)節(jié)解析干燥和升華干燥的條件，故本次實(shí)驗(yàn)僅對(duì)預(yù)凍溫度進(jìn)行了考察。納米混懸液屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，凍干制劑特有的疏松多孔結(jié)構(gòu)可以使藥物重新吸水而恢復(fù)活性，而且凍干制劑含水量低，易長(zhǎng)期穩(wěn)定保存[10]。冷凍干燥是一個(gè)復(fù)雜的物理化學(xué)變化過程[11]，凍干保護(hù)劑的選擇或濃度控制不當(dāng)會(huì)使凍干產(chǎn)品外觀致密、不易復(fù)溶[12]。故本實(shí)驗(yàn)從預(yù)凍溫度和凍干保護(hù)劑的角度對(duì)凍干工藝進(jìn)行了考察，以便更好地提高其貯存穩(wěn)定性。

本文研究了阿苯達(dá)唑納米混懸液的凍干工藝，結(jié)果表明，未加凍干保護(hù)劑的凍干粉粒徑較大，且凍干過程中易于沸騰和鼓泡，較不穩(wěn)定。而本實(shí)驗(yàn)選用的凍干保護(hù)劑溶解度大、濃度較低，溶解后呈均一溶液狀態(tài)（粒子直徑＜1 nm），在ZEN3690 激光粒度分布儀上無(wú)法測(cè)出粒徑，對(duì)納米微粉的粒徑測(cè)量影響較小。筆者經(jīng)單因素考察后制備的阿苯達(dá)唑納米微粉不易鼓泡，凍干產(chǎn)品的外觀相對(duì)松散。通過凍干工藝優(yōu)化，制得的納米微粉平均粒徑為200 nm左右，Zeta電位等指標(biāo)較優(yōu)，工藝簡(jiǎn)單易行、重現(xiàn)性好；且本品在水中較易分散，再分散性較好，達(dá)到了凍干實(shí)驗(yàn)的目的。因此為了提高實(shí)驗(yàn)效率，沒有再選用正交實(shí)驗(yàn)等方法。納米微粉不僅有效提高了阿苯達(dá)唑納米混懸液的穩(wěn)定性，而且提高了阿苯達(dá)唑在水中的溶解度，對(duì)阿苯達(dá)唑納米微粉的進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，提供了理論依據(jù)。本品有望制成一種新型的阿苯達(dá)唑納米制劑。

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