吳國麗，李飛飛，劉銳玲，曲婷麗，李 夏，趙正保#（.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化教研室，太原 03000；.山西職工醫(yī)學(xué)院病生教研室，太原 03069）

4-氨基水楊酸（4-aminosalicylic acid，4-ASA）在20世紀(jì)80年代作為抗結(jié)核藥物運(yùn)用于臨床，后期又發(fā)現(xiàn)其可治療潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC），且安全穩(wěn)定、耐受性良好、廉價(jià)易得，療效與傳統(tǒng)抗UC 藥物5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）相比更強(qiáng)[1]，不會(huì)產(chǎn)生5-ASA引起的急性胰腺炎[2]。此外，糖類分子現(xiàn)在被廣泛用于口服劑型的開發(fā)，用于將藥物靶向釋放到結(jié)腸部位發(fā)揮治療作用[3]。糖類分子能夠靶向釋藥的理論基礎(chǔ)是：糖結(jié)合型藥物對于大量存在于結(jié)腸中菌群產(chǎn)生的糖苷酶非常敏感，糖苷酶可以使前體藥物的糖苷鍵斷裂并釋放母體藥物[4]。

為了避免和減少4-ASA口服后在胃腸道上部吸收并代謝失活，提高其在結(jié)腸的藥物濃度并減少用藥劑量，本課題制備了4-ASA 麥芽糖苷（4-aminosalicylic acid-maltoside，4-ASAMal）酶依賴型結(jié)腸靶向口服前藥。本文為了驗(yàn)證4-ASA-Mal的結(jié)腸靶向性，對其進(jìn)行了體外釋放度的研究。

1 材料

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent 公司）；TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；TGL-16G 型高速離心機(jī)（上海飛鴿儀器公司）；HH-2型電子恒溫水浴鍋（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司）；AL104 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PHS-3C型pH 計(jì)（上海雷磁儀器廠）

1.2 藥品與試劑

4-ASA-Mal（山西醫(yī)科大學(xué)藥化教研室自制，批號(hào)：20130501、20130502、20130503，純度：≥98%）；4-ASA 對照品（美國Sigma公司，批號(hào)：20130904，純度：≥98%）；甲醇為色譜純；試驗(yàn)用水為去離子雙蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Innoval C18（250 mm×4.6 mm，4.6μm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 2.7）（10∶90，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：263 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 內(nèi)容物樣品處理

取大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，用乙醚麻醉，剪開腹腔，分離胃、小腸、盲腸和結(jié)腸，剪開，收集各段內(nèi)容物于具塞塑料離心管，按1 ∶4（m/V）分別加入0.1 mol/L HCl、pH 6.8 PBS、pH 7.4 PBS、pH 7.4 PBS，勻漿[5]，－20 ℃冷凍備用（盲結(jié)腸內(nèi)容物的處理及離心管和緩沖液預(yù)先用氮?dú)馓幚砗茫?/p>

2.3 方法專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取4-ASA 對照品溶液，正常大鼠胃、小腸、盲腸、結(jié)腸的空白內(nèi)容物液和內(nèi)容物樣品液，進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果顯示，4-ASA 的保留時(shí)間約為10 min，空白內(nèi)容物不干擾其測定。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下空白內(nèi)容物液0.2 ml，置于1.5 ml離心管中，加入0.8 ml不同質(zhì)量濃度的4-ASA 對照品溶液，制成含4-ASA終質(zhì)量濃度為2.0、8.0、32.0、64.0、160.0、200.0μg/ml的樣品溶液，混勻，渦旋，以3 000×g離心10 min，吸取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，取20 μl 進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以4-ASA 峰面積（A）對4-ASA 質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得各段內(nèi)容物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

結(jié)果表明，上述各段胃腸道內(nèi)容物液中的4-ASA 質(zhì)量濃度在2.0～200.0μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

取大鼠不同部位空白胃腸道內(nèi)容物液，按“2.4”項(xiàng)下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度（160、64、8μg/ml）的4-ASA質(zhì)控樣品，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。同日測定5次，考察計(jì)算日內(nèi)精密度；每日測定1 次，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度。結(jié)果，本法的回收率為（89.54±0.60）%～（97.02±0.20）%；日內(nèi)RSD均小于4.58%，日間RSD均小于5.48%（n＝5）。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備大鼠不同部位空白胃腸道內(nèi)容物液中含4-ASA終質(zhì)量濃度為64μg/ml的質(zhì)控樣品，在37 ℃、自然光條件下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h依法測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD均小于2.17%，表明大鼠胃、小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物質(zhì)控樣品中4-ASA在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 4-ASA-Mal體外靶向釋藥研究

2.7.1 不同pH 緩沖液 取7 只離心管加入0.1 mol/L HCl 0.2 ml、4-ASA-Mal 溶液0.8 ml（相當(dāng)于4-ASA 250 μg/ml）[6]，渦旋混勻。于37 ℃水浴孵育0.5、1、2、4、6、8、12 h 后，用混勻器振蕩20 s，以3 000×g離心10 min，吸取上清液，用0.45μm濾膜過濾，取20μl 進(jìn)樣測定，計(jì)算4-ASA 的累積釋放率。同法測定4-ASA-Mal 在pH 6.8 和pH 7.4 PBS 中4-ASA的累積釋放率。4-ASA-Mal在不同pH緩沖液中的釋放曲線見圖2。

由圖2 可知，4-ASA-Mal 在不同pH 緩沖液中孵育后幾乎未檢測到4-ASA。結(jié)果表明，4-ASA-Mal 在不同pH 條件下幾乎不釋放4-ASA。

圖1 高效液相色譜圖A.4-ASA對照品；B.胃空白內(nèi)容物；C.小腸空白內(nèi)容物；D.盲腸空白內(nèi)容物；E.結(jié)腸空白內(nèi)容物；F.胃內(nèi)容物樣品；G.小腸內(nèi)容物樣品；H.盲腸內(nèi)容物樣品；I.結(jié)腸內(nèi)容物樣品；1.4-ASAFig 1 HPLC chromatogramA.4-ASA control；B.blank stomach content；C.blank small intestinal content；D.blank cecum content；E.blank colon content；F.sample of stomach content；G.sample of small intestinal content；H.sample of cecum content；I.sample of colon content；1.4-ASA

表1 回歸方程及其相關(guān)系數(shù)Tab 1 Regression equations and the correlation coefficients

2.7.2 正常大鼠內(nèi)容物液 分別取“2.2”項(xiàng)下胃、小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物液0.2 ml，置于塑料離心試管中，加入4-ASA-Mal藥物溶液0.8 ml（相當(dāng)于4-ASA 250 μg/ml），混勻。然后按“2.7.1”項(xiàng)下操作計(jì)算累積釋放率。4-ASA-Mal 在正常大鼠不同內(nèi)容物液中的釋放曲線見圖3。

由圖3可知，4-ASA-Mal在正常大鼠胃和小腸內(nèi)容物液中孵育12 h，4-ASA 累積釋放率小于8%；在正常盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物液中孵育12 h，累積釋放率分別約為55%和81%。

圖2 4-ASA-Mal在不同pH緩沖液中的釋放曲線（n＝3）Fig 2 Release curves of 4-ASA-Mal in the buffer solutions of different pHs（n＝3）

圖3 4-ASA-Mal 在正常大鼠不同內(nèi)容物液中的釋放曲線（n＝3）Fig 3 Release curves of 4-ASA-Mal in different aqueous contents in normal rats（n＝3）

以上結(jié)果表明，4-ASA-Mal 在不同pH 條件下不釋放4-ASA，只在特定酶的作用下釋放4-ASA，從而在盲結(jié)腸形成高濃度藥物濃度，達(dá)到靶向釋藥目的，發(fā)揮其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的治療作用。

2.7.3 潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠胃腸道內(nèi)容物液 取大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h，用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎模型[7]。復(fù)制模型成功后第3天，用乙醚麻醉，從腹中線切開分別取出胃、小腸、盲腸、結(jié)腸的模型大鼠內(nèi)容物，后續(xù)處理同“2.7.2”項(xiàng)，計(jì)算累積釋放率。4-ASA-Mal 在模型大鼠不同內(nèi)容物液中的釋放曲線見圖4。

圖4 4-ASA-Mal 在模型大鼠不同內(nèi)容物液中的釋放曲線（n＝3）Fig 4 Release curves of 4-ASA-Mal in different aqueous contents in model rats（n＝3）

由圖4可知，4-ASA-Mal在模型大鼠胃和小腸內(nèi)容物液中孵育12 h，4-ASA 累積釋放率小于8%；在模型大鼠盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物液中孵育12 h，累積釋放率分別為55%和74%。上述結(jié)果表明，4-ASA-Mal在模型大鼠胃腸道內(nèi)容物液中的體外孵化中，可大量釋放母藥4-ASA。

3 討論

對于結(jié)腸定位制劑的體外測定，《中國藥典》的方法也不能完全模擬胃腸的環(huán)境（腸道pH、細(xì)菌數(shù)量、酶的活性、流體容量和內(nèi)容物的混合強(qiáng)度）；即使相關(guān)研究[8]同時(shí)考察了胃腸道的特異性酶系對藥物釋放的影響，也只單純地加入了幾種純化酶，進(jìn)行體內(nèi)生理環(huán)境的簡單模擬，不能充分反映藥物在正常和潰瘍性結(jié)腸炎體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境，其方法有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)綜合考慮藥物在正常大鼠和潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的各種生理環(huán)境和體內(nèi)影響因素，在不同pH 緩沖液的基礎(chǔ)上加入了正?；驖冃越Y(jié)腸炎模型大鼠胃腸道相應(yīng)部位的內(nèi)容物，更真切地模擬了體內(nèi)胃腸道的菌和酶的生存環(huán)境；同時(shí)充入氮?dú)饽M了盲腸和結(jié)腸的無氧環(huán)境，能更真實(shí)地反映藥物的結(jié)腸靶向釋放程度。

在體外孵化產(chǎn)物中未能檢測出有乙?；?-ASA，說明在體外大鼠胃腸道內(nèi)容物內(nèi)缺乏乙?；?，不能生成乙酰化4-ASA。

4-ASA-Mal在0.1 mol/L HCl和pH 6.8、pH 7.4 PBS中幾乎不釋藥，而在與人體盲結(jié)腸部位酶環(huán)境非常類似的大鼠盲結(jié)腸內(nèi)容物中檢測到大量4-ASA，初步證明基于糖苷鍵合成的4-ASA-Mal 并無pH 依賴性，其分解與內(nèi)容物中酶的作用有關(guān)。后續(xù)將進(jìn)一步對4-ASA-Mal進(jìn)行大鼠體內(nèi)代謝研究。

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