黃金蘭，秦嫦云，周 楠，高 山，杜 偉，謝艷秋，王 霞，施 倩，吳登攀（徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州 221004）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）又稱老年性癡呆，好發(fā)于老年人。在眾多的AD 發(fā)病機(jī)制學(xué)說中，氧化應(yīng)激學(xué)說越來越受到學(xué)術(shù)界的重視，從氧化應(yīng)激角度研發(fā)的防治AD 的新藥可延緩AD 病程的發(fā)展，對AD 的早期治療具有非常重要的意義。氧化應(yīng)激是指氧化物超過了機(jī)體內(nèi)源性的抗氧化能力從而引起分子氧化，產(chǎn)生高度活性的羥自由基及單個氧原子等活性氧類（ROS）。正常生理?xiàng)l件下，人體具備一個完整的抗氧化防御系統(tǒng)，如酶類抗氧化系統(tǒng)。所以機(jī)體的氧化水平與抗氧化水平在各種因素的參與下保持著動態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體受到有害刺激時，ROS產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除能力，則可直接引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA等胞內(nèi)大分子的氧化，損害細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，基本上所有的胞內(nèi)大分子（蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等）在AD患者的腦組織中都可以發(fā)現(xiàn)有氧化形式的存在，且氧化應(yīng)激在AD患者發(fā)病早期就已經(jīng)出現(xiàn)[1]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的堿基氧化產(chǎn)物超過30種，其中鳥嘌呤氧化生成的8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）是最重要的變異源性物質(zhì)，被公認(rèn)為是DNA 氧化損傷的標(biāo)志物[2]。研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NGR1）可通過提高抗氧化物酶的活性，從而減輕氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元損傷[3-4]；還可通過提高神經(jīng)元突觸可塑性而提高AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能[5]。然而NGR1是否可以通過減輕氧化應(yīng)激而改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。筆者擬以NGR1為研究對象，通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激癡呆小鼠模型（即AD小鼠模型），探討NGR1對該模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并通過檢測小鼠血清和腦組織中抗氧化酶系活性及腦組織內(nèi)氧化產(chǎn)物的含量，初步闡明NGR1影響AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制，為研發(fā)防治AD的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ACT-200 型水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)（美國Coulbourn 公司）；722N 型可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Elx808 型酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；5804R 型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

NGR1（南京廣潤生物制品有限公司，批號：GR-133-140324，純度：≥98.0%）；吡拉西坦片（廣東華南制藥有限公司，批號：110102，規(guī)格：每片0.4 g）；D-半乳糖（上海源葉生物科技有限公司，批號：YY11147）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成科技有限公司，批號：A001-1、A005、A007-1）：小鼠8-OHdG酶聯(lián)免疫分析試劑盒（徐州微科曼得生物工程有限公司，批號：V02165M）。

1.3 動物

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

將50 只昆明小鼠隨機(jī)均分為正常組、模型組、陽性對照（吡拉西坦，150 mg/kg）組和NGR1低、高劑量（12.5、25 mg/kg）組（劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），除正常組每日頸背部ih 等容生理鹽水外，其余各組每日頸背部ih 10%D-半乳糖（0.01 ml/g）以復(fù)制氧化應(yīng)激引起的AD 小鼠模型，qd；并于造模同時ig 相應(yīng)藥物，正常組和模型組ig蒸餾水，qd，連續(xù)4周。

2.2 小鼠記憶行為能力測定

給藥結(jié)束后，采用Morris 水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠的記憶行為能力。水迷宮為直徑150 cm、高50 cm 的圓形水池，水深約32 cm，其中放置一個直徑為17 cm、高30 cm的圓形平臺，水溫保持（25±2）℃。將小鼠面向池壁由4個入水點(diǎn)放入池中，記錄其90 s 內(nèi)成功進(jìn)駐平臺（小鼠找到平臺并在平臺上滯留5 s為成功進(jìn)駐）所需時間。如在90 s內(nèi)不能成功進(jìn)駐平臺，則將其引上平臺并令其停留10 s。每只鼠每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練時間間隔為30～40 min，共訓(xùn)練4 d。獲得性訓(xùn)練結(jié)束后，撤除平臺，將小鼠由原先平臺象限對側(cè)放入水中，記錄其在原平臺所在象限游泳的時間占總游泳時間的百分比，即原平臺象限游泳時間百分比。

2.3 小鼠血清及大腦組織樣品的制備

實(shí)驗(yàn)動物行為學(xué)檢測后，對小鼠眼球取血并盛于離心管中，靜置30 min，待血液凝固后以離心半徑為8 cm（下同）、3 000 r/min 離心10 min，吸取上清（即血清）備用。再于冰臺上迅速剝離小鼠大腦組織，預(yù)冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干多余水分后稱質(zhì)量，按質(zhì)量-體積比1 ∶9加入預(yù)冷生理鹽水，玻璃勻漿器制成10%的腦勻漿液，于高速冷凍離心機(jī)中以14 000 r/min離心10 min，取上清，并用二辛可酸（BCA）法檢測蛋白濃度。

2.4 指標(biāo)檢測

采用可見分光光度法測定小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX、CAT活性，具體操作按T-SOD、GSH-PX、CAT試劑盒說明書進(jìn)行，并按試劑盒說明書中公式計算相應(yīng)酶活力。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠腦組織中8-OHdG含量，具體步驟及含量計算方法參見8-OHdG酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 NGR1對模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與正常組比較，模型組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比測定結(jié)果（，n＝10）Tab 1 The results of the percentage of swimming time in original platform quadrant of mice in each group（，n＝10）

表1 各組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比測定結(jié)果（，n＝10）Tab 1 The results of the percentage of swimming time in original platform quadrant of mice in each group（，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

3.2 NGR1對模型小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX 和CAT活性的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX、CAT 的活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，NGR1低、高劑量組及陽性對照組血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX、CAT的活性均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX和CAT活性檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 2 The results of activities of T-SOD，GSH-PX and CAT in serum and cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

表2 各組小鼠血清及腦組織中T-SOD、GSH-PX和CAT活性檢測結(jié)果（，n＝10）Tab 2 The results of activities of T-SOD，GSH-PX and CAT in serum and cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.3 NGR1對模型小鼠腦組織中8-OHdG含量的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠腦組織中8-OHdG含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，NGR1低、高劑量組及陽性對照組小鼠腦組織中8-OHdG含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠腦組織中8-OHdG 含量測定結(jié)果（，n＝10）Tab 3 The results of content determination of 8-OHdG in cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

表3 各組小鼠腦組織中8-OHdG 含量測定結(jié)果（，n＝10）Tab 3 The results of content determination of 8-OHdG in cerebral tissue of mice in each group（，n＝10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

4 討論

D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激AD模型是通過D-半乳糖誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自由基、脂質(zhì)過氧化等氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶能力衰退的癡呆模型[6]。其造模周期短、衰老變化明顯、穩(wěn)定性好，是目前國際上較為公認(rèn)的癡呆模型。本實(shí)驗(yàn)建立D-半乳糖誘導(dǎo)AD小鼠模型，并在行為學(xué)、氧化與抗氧化應(yīng)激方面對其進(jìn)行評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比及血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX 和CAT 的活性均明顯降低（P＜0.01），而腦組織中DNA 的氧化產(chǎn)物8-OHdG 含量則明顯升高（P＜0.01），此結(jié)果與文獻(xiàn)[7]報道一致，提示模型小鼠出現(xiàn)明顯衰老體征、記憶能力下降、抗氧化酶活力下降，D-半乳糖誘導(dǎo)的AD 模型是成功的。

文獻(xiàn)報道三七總皂苷（PNS）可通過降低AD 模型大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[8]，而作為PNS的主要單體成分之一的NGR1可通過提高抗氧化物酶的活性，從而減輕氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元損傷[1-2]。吡拉西坦是一種經(jīng)典的腦代謝活化劑，其能夠增加腦血流量，促進(jìn)代謝，增強(qiáng)腦部左右兩半球間神經(jīng)信息的傳遞，具有較強(qiáng)的抗腦缺氧作用，可保護(hù)外源性傷害性刺激對大腦的損害，改善學(xué)習(xí)和記憶等功效[9]，故本實(shí)驗(yàn)以其為陽性對照藥物。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，給藥組小鼠的原平臺象限游泳時間百分比明顯延長（P＜0.01），提示NGR1可改善D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；生化檢測結(jié)果顯示藥物處理組的小鼠血清和腦組織中T-SOD、GSH-PX 和CAT 的活性均高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），而腦組織中DNA 的氧化產(chǎn)物8-OHdG含量則明顯降低（P＜0.01），提示NGR1可提高氧化應(yīng)激AD模型小鼠血清及腦組織中SOD、GSH和CAT的活性，并可顯著降低腦組織中DNA的氧化產(chǎn)物8-OHdG的水平。

綜上所述，NGR1可通過減輕氧化應(yīng)激從而改善AD 模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，是有潛力的AD治療藥物。

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