黃　琳

(四川省資陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 資陽(yáng) 641300)

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緩激肽對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老影響的臨床研究

黃琳

(四川省資陽(yáng)市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 資陽(yáng) 641300)

摘要：目的分析緩激肽對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老的影響。方法通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行研究，將氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的衰老的心肌細(xì)胞按照處理方法不同分為3組：正常細(xì)胞組、緩激肽組和對(duì)照組，各35個(gè)心肌細(xì)胞數(shù)。其中正常細(xì)胞組未加入過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，單純加入緩激肽；緩激肽組將緩激肽加入由過(guò)氧化氫氧化誘導(dǎo)的衰老的H9C2細(xì)胞；對(duì)照組單純接受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞，未加入緩激肽。結(jié)果隨著緩激肽的濃度增加，衰老細(xì)胞的個(gè)數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，不同濃度緩激肽之間衰老細(xì)胞對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。正常細(xì)胞組細(xì)胞衰老率顯著低于緩激肽組和對(duì)照組(P<0.01)，緩激肽組細(xì)胞衰老率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。3組Oliver尾含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，緩激肽組Oliver尾含量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，但高于正常細(xì)胞組(P<0.01)。結(jié)論緩激肽能夠有效保護(hù)由氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的衰老，能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞DNA的損傷程度。

關(guān)鍵詞：緩激肽；氧化應(yīng)激反應(yīng)；心肌細(xì)胞；衰老

緩激肽是激肽的一種，主要存在于組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中。組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)存在于人體和動(dòng)物的各種組織內(nèi)，通過(guò)信號(hào)通道而產(chǎn)生各種的生物學(xué)作用[1-3]，參與器官的功能調(diào)節(jié)以及各種病理和生理過(guò)程，對(duì)心血管疾病、肝腎系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等有較大意義的調(diào)節(jié)作用?？山M織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)參與機(jī)體中細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程。其中緩激肽是不同激肽釋放酶作用下的不同產(chǎn)物，是在生理化學(xué)條件下的主要激肽類(lèi)物質(zhì)[4]。同時(shí)緩激肽也參與血管收縮調(diào)節(jié)，屬于血管舒張因子，可以參與小動(dòng)脈的擴(kuò)張調(diào)節(jié)，使動(dòng)脈局部血流增加，提高血管通透性，起到降壓的作用，因此對(duì)心血管疾病有一定的調(diào)節(jié)和藥理作用。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯，具有不可逆性和永久性[5-7]。出現(xiàn)衰老狀態(tài)的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上會(huì)出現(xiàn)改變，包括細(xì)胞中的核膜出現(xiàn)內(nèi)折，細(xì)胞組織的脆性增加，細(xì)胞皺褶縮小，細(xì)胞器顯著性減少。其中心肌細(xì)胞衰老與心臟衰竭之間存在一定的關(guān)系。而緩激肽對(duì)機(jī)體內(nèi)部的氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定的調(diào)節(jié)作用，而氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度影響細(xì)胞的衰老速度和過(guò)程。本研究主要觀察緩激肽對(duì)受氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料將通過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的衰老的心肌細(xì)胞(杰蘭爾上?？蒲畜w外第三方檢測(cè)公司銷(xiāo)售的美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))按照處理方法的不同分為3組：正常細(xì)胞組、緩激肽組和對(duì)照組，各35個(gè)心肌細(xì)胞數(shù)。

1.2儀器和試劑儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱，低速離心儀，普通倒置顯微鏡，潔凈工作臺(tái)，酶標(biāo)儀，DNA濃度測(cè)定儀，冰箱，微量加樣器。試劑：DMEM培養(yǎng)液，HOE140和L-NAME(均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，胎牛血清(由美國(guó)GIBCO公司提供)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，彗星電泳法試劑盒。單克隆小鼠抗β-actin抗體和多克隆兔抗p21抗體(均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.3方法對(duì)照組：將心肌細(xì)胞(H9C2)在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待其傳代至12代后，更換含有0.5%的胎牛血清的高糖DMMEM的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，再換用不含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液中放置不同濃度的過(guò)氧化氫，使H9C2心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的DNA損傷以及衰老。約2 h后，即可將細(xì)胞從培養(yǎng)液中提取，并且用磷酸緩沖液進(jìn)行洗滌，一般需要將細(xì)胞用磷酸緩沖液洗滌3次，再將細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。緩激肽組：在對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加入緩激肽對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，首先需將HOE-140以及L-NAME加入培養(yǎng)液中與細(xì)胞混合，約5 min后加入緩激肽。約30 min后加入過(guò)氧化氫再培養(yǎng)2 h。正常細(xì)胞組：不加入過(guò)氧化氫，只加入緩激肽。操作同上。

為了觀察不同濃度的緩激肽對(duì)H9C2細(xì)胞衰老程度的影響，將H9C2細(xì)胞分別置于不同濃度的過(guò)氧化氫溶液中2 h，濾去培養(yǎng)液，將其更換至新的培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，用衰老相關(guān)性β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法以及胱天蛋白酶3活性檢測(cè)試劑盒等方法檢測(cè)細(xì)胞活性，觀察細(xì)胞的衰老情況以及其凋亡的情況等，經(jīng)染色的衰老細(xì)胞呈綠色。

另外，將接受緩激肽干預(yù)后的H9C2細(xì)胞用磷酸緩沖液進(jìn)行洗滌后以離心半徑15 cm,600 r/min離心15 min，彗星實(shí)驗(yàn)觀察心肌細(xì)胞的DNA損傷程度。

1.4觀察指標(biāo)采用SA-β-gal染色法在顯微鏡下觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)。對(duì)于DNA損傷程度的分析則采用CASP軟件測(cè)定Olive尾含量，以確定DNA的損傷程度。

2結(jié)果

2.1不同濃度的緩激肽對(duì)心肌細(xì)胞的影響不同濃度的緩激肽干預(yù)心肌細(xì)胞后，衰老細(xì)胞在顯微鏡下的數(shù)據(jù)顯示，隨著緩激肽的濃度增加，衰老細(xì)胞的個(gè)數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.926，P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　不同濃度的緩激肽對(duì)心肌細(xì)胞的影響

2.2緩激肽對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老情況影響正常細(xì)胞組細(xì)胞衰老率顯著低于緩激肽組和對(duì)照組(χ2=8.741，44.947，P<0.01)，緩激肽組細(xì)胞衰老率顯著低于對(duì)照組(χ2=7.305，P<0.01)；緩激肽組p21光密度比值顯著低于對(duì)照組(t=5.302，P<0.01)，緩激肽組和對(duì)照組p21密度值高于正常細(xì)胞組(t=3.751，6.021，均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　緩激肽對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞衰老情況影響

a與正常細(xì)胞比較，P<0.05；b與緩激肽組比較，P<0.05

2.3DNA損傷程度3組Oliver尾含量的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，正常細(xì)胞組未加入過(guò)氧化氫，其Oliver尾長(zhǎng)度最短。而緩激肽組Oliver尾含量顯著低于對(duì)照組(t=7.026，P<0.01)，但高于正常細(xì)胞組(t=10.583，P<0.01)，對(duì)照組含量高于正常細(xì)胞組(t=7.963，P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3DNA損傷程度比較

組別心肌細(xì)胞數(shù)Oliver尾含量 正常細(xì)胞351.5±0.2 緩激肽組351.9±0.1a 對(duì)照組 352.1±0.1ab F2.402 P<0.01

a與正常細(xì)胞比較，P<0.05；b與緩激肽組比較，P<0.05

3討論

內(nèi)皮細(xì)胞衰老是一種不可逆的且具有細(xì)胞周期依賴(lài)性的過(guò)程，導(dǎo)致人體內(nèi)皮細(xì)胞衰老的原因主要是由于DNA受到損傷。其中以氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的DNA損傷較大。衰老或者損傷的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致機(jī)體釋放一系列的收縮因子和炎性因子，導(dǎo)致出現(xiàn)各種臨床癥狀，如高血壓，心力衰竭或者動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。緩激肽屬于組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中的一種激肽。激肽主要是通過(guò)兩個(gè)途徑在人體體內(nèi)以局部激素的形式結(jié)合緩激肽的受體對(duì)相鄰細(xì)胞等發(fā)揮作用。緩激肽主要有β1和β2兩種受體[8]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，β2受體在正常機(jī)體中可以發(fā)現(xiàn)并存在，其表達(dá)較多，一般對(duì)賴(lài)氨酸緩激肽和緩激肽等較為敏感。由于β2受體負(fù)責(zé)調(diào)解和介導(dǎo)心血管效應(yīng)，體內(nèi)電解質(zhì)的代謝情況以及對(duì)器官等保護(hù)功能，緩激肽對(duì)于以上的生理作用具有一定的臨床意義。本研究主要以H9C7細(xì)胞模擬心肌細(xì)胞，過(guò)氧化氫模擬機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，觀察加入緩激肽干預(yù)后，細(xì)胞的衰老情況以及相關(guān)DNA的損傷程度等。本研究結(jié)果顯示，緩激肽在氧化應(yīng)激反應(yīng)下誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，能夠有效減少衰老細(xì)胞的個(gè)數(shù)以及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的DNA損傷程度，從而能夠有效延緩心肌細(xì)胞的衰老程度。緩激肽對(duì)于心肌細(xì)胞延緩衰老具有臨床研究的價(jià)值。緩激肽在心血管中具有不可替代的作用，其主要的生理調(diào)節(jié)作用包括擴(kuò)張血管以及調(diào)節(jié)血壓，保護(hù)心肌發(fā)生缺血以及降低再灌注后對(duì)心肌的損傷，延緩心力衰竭的病情進(jìn)展。另外，緩激肽還具有對(duì)心臟結(jié)構(gòu)變化的影響，由于緩激肽具有降低血壓以及增強(qiáng)心肌收縮力的作用，能夠緩解心肌纖維化的速度和程度，而起到影響心臟結(jié)構(gòu)變化的作用[9]。

大量的研究表明，組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)在各種心血管病發(fā)病機(jī)制中具有較為重要的臨床作用。另外，特異性受體是目前靶向藥物的研究熱點(diǎn)，了解組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中各個(gè)激動(dòng)劑和抑制劑的作用能夠有助于各種疾病的臨床治療，特別是緩激肽的研究。對(duì)于相關(guān)的靶向藥物的研究能夠研發(fā)新一代的具有更高選擇性的靶向藥物，在治療心血管疾病，疼痛以及細(xì)胞衰老等方面能夠有突破性的進(jìn)展。緩激肽對(duì)于氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)而出現(xiàn)的心肌細(xì)胞衰老等保護(hù)作用應(yīng)該予以足夠的重視和研究，有助于臨床上相應(yīng)藥物和治療方案的研發(fā)和制訂。

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Clinical Study on the Effect of Bradykinin on Oxidative Stress-induced Myocardial Cell Aging

HUANGLin.

(DepartmentofCardiology,ZiyangFirstPeople′sHospital,Ziyang641300,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the effect of bradykinin on oxidative stress-induced myocardial cell aging.MethodsCultured samples of oxidative stress-induced aging myocardial cells were divided into normal cells group,bradykinin group and control group,with 35 myocardial cells in each group.Cells in normal cells group were not induced by hydrogen peroxide but singly by bradykinin;bradykinin was added to the aging H9C2 cells in bradykinin group induced by hydrogen peroxide;and H9C2 cells in control group were singly induced by hydrogen peroxide,without adding bradykinin.ResultsWith increasing concentrations of bradykinin,the number of aging cells showed a downward trend,differences of the aging cell numbers between different concentrations of bradykinin were statistically significant(P<0.01).The aging rate of cells in normal cells group was significantly lower than those of bradykinin group and control group(P<0.01);aging rate of cells in bradykinin group was significantly lower than the control group(P<0.01).Differences of Oliver ending contents between either two of three groups were statistically significant(P<0.01), Oliver ending content of bradykinin group was significantly lower than the control group(P<0.01),while higher than normal cells group(P<0.01).ConclusionBradykinin can effectively protect the oxidative stress-induced myocardial cell from aging,and inhibit the DNA damage to myocardial cells caused by oxidative stress.

Key words:Bradykinin; Oxidative stress; Myocardial cells; Aging

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.03.064

中圖分類(lèi)號(hào)：R453

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)03-0546-02

收稿日期：2014-01-24修回日期：2014-07-15編輯：伊姍